学术报告

1. 学术报告 光敏纳米基因载体制备研究 报 告 人：颜建民 学 号：2012207256 日 期：2013-03-16

2. 1.基因治疗和纳米基因载体简介 1.1基因治疗的概述 所谓基因治疗(GeneTherapy)，是以改变人的遗传物质为基础的生物学治疗，是指将人体正常基因或者有治疗作用的基因通过一定的方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的治疗方法 基因治疗的对象主要是那些严重威胁人类生命健康和生活质量的疾病，如遗传病、肿瘤和病毒性疾病等 基因治疗是伴随着基因工程技术和分子生物学的发展而逐渐形成的一种新型分子治疗手段

3. 1.基因治疗和纳米基因载体简介 1.2基因治疗中存在的最主要难题 虽然近年来基因治疗取得了很大发展，但当前基因治疗研究中仍存在很多技术性的难题，其中之一就是治疗基因的有效传输 由于治疗基因（包括DNA、RNA以及反义寡核甘酸）容易在传输的过程中被血液、组织或者胞浆中的酶类所降解，生物半衰期很短 治疗基因是高度亲水的大分子物质，在生理条件下带有较强的负电性，因此难以穿透细胞膜进入靶细胞

4. 1.基因治疗和纳米基因载体简介 1.3纳米基因载体 现存病毒载体存在安全性问题，传统的非病毒载体的传递效率比较低，这些问题等问题己经成为限制基因治疗进一步发展的瓶颈 随着纳米生物技术的飞速发展，一种新型的非病毒载体系统-纳米基因载体系统的出现为基因治疗注入了新的活力 纳米基因载体是将基因治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面，同时也可在颗粒表面偶联特异性的靶向分子，通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合，在细胞摄取作用下进入细胞内，实现安全有效的靶向性药物和基因治疗

5. 1.基因治疗和纳米基因载体简介 1.4纳米基因载体的优点 ※非生物材料,无免疫原性 ※无遗传毒性与细胞毒性 ※由于其特殊的结构及表面电荷,具有很高的 基因转移效率由于其特殊的结构及表面电荷，具有很高的基因转移效率 ※纳米载体可保护转导基因不受机体血浆或组织细胞中各种补体以及各种酶的破坏，有利于目的基因在转导进入靶细胞后能更好的发挥作用 ※具备较小的粒径，容易逃避体内巨噬细胞的吞噬，更利于被靶细胞捕捉

6. 2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默 2.1金纳米的合成与修饰 金纳米是核-壳型纳米材料的一种，是指由二氧化硅及包覆于其上形成均匀壳层的金所构成的特殊结构纳米材料。 具有由强烈的光学吸收和光学散射所构成的等离子体共振性能，而这种等离子体共振的频率可以通过改变核半径与壳厚度的相对尺寸来进行系统地调节通过对核壳比例进行调节，可以制备出光学共振范围从可见光到中红外的纳米壳层

7. 2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默 2.1金纳米的合成与修饰 正硅酸乙酯在乙醇-水碱性条件混合室温下缩聚生成氧化硅纳米球，然后将3-氨基丙基三乙氧基硅烷接枝到氧化硅球表面 将氧化硅球分离出来后，加入细小的金胶体溶液，金胶体与胺基基团结合在一起，在氧化硅球表面的覆盖率约30％。随后，将载有金胶体的氧化硅球与经过老化处理、含有HAuCl4和K2C03的溶液均匀混合，并使用氢硼化钠溶液进行还原。氧化硅球上的金胶体粒子将成为成核部位，随着还原反应的进行，金粒子将不断生长、相连，最终在氧化硅球表面形成了金的包覆层

8. 2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默 2.1金纳米的合成与修饰 本次实验采用光的波长为800nm，按照文献，将金纳米球中二氧化硅核直径为60nm，金纳米球直径为82nm 金纳米球拥有的金-硫醇键，可以非常容易的用一些配体和定位集团修饰纳米壳表面。 过量的PLL多肽（cysteine (C)-tyrosine(Y) -serine(S) - lysine(K)50）添加到纳米壳悬浮溶液中。在室温下震荡孵育24h。剩余的PLL多肽通过2个离心周期去除

9. 2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默

10. 2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默 2.2热和光两种方式引起ssDNA的释放 对于热触发三种荧光标记ssDNA释放的研究，溶液在水浴条件下缓慢加热。对于光触发释放的研究中，由于增加激光照射强度使得纳米壳温度升高，进而使得周围溶液温度相应的升高。

11. 2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默 2.2热和光两种方式引起ssDNA的释放 (A) short ssDNA (B)phosphorothioate-modified short ssDNA (18 bases), (C) long ssDNA ( 50 bases) .

12. 2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默 2.2热和光两种方式引起ssDNA的释放 NS-PLL对荧光标记的ssDNA装载能力 2个eppindorf管各装入 500μLNS-PLL-ssDNA，一个管中加入500μL的TE缓冲液，另一个管加入12mM的巯基乙醇，将二者用铝箔封口，24h震荡。巯基乙醇可以破坏PLL和ssDNA与纳米球的相互作用，进而释放ssDNA。24h后，离心去除纳米球，分子荧光光谱仪测定激发波长495nm，发射波长505nm-540nm。通过DNA浓度与荧光强度之间的标准曲线可以计算得到样品中DNA浓度。得到DNA浓度后再除以纳米球浓度便可以得到每个纳米球的装载量。

13. 2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默 2.2热和光两种方式引起ssDNA的释放 NS-PLL对荧光标记的ssDNA装载能力

14. 2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默 2.3细胞对载体系统的吸收 为促进细胞吸收，NS-PLL与H1299细胞在血清培养基孵育2h。孵育后使用暗视野显微镜和荧光显微镜进行观察。每个细胞吸收纳米壳的数量由电感耦合等离子体质谱法检测。金纳米可以吸收和散射光，这使它们成为衍射极限的亮点，在暗视野很容易观察到。细胞膜以红色荧光染料标记。

15. 2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默 2.3细胞对载体系统的吸收 Figure 2. Cell uptake of NS-PLL delivery vectors in H1299 cell

16. 2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默 2.4基因治疗剂在体外降低绿色荧光蛋白的表达 为研究NS-PLL在体外释放RNAi寡核苷酸治疗剂的能力，我们使用绿色荧光显微镜来观察被荧光标记的ssDNA在h1299癌细胞中的释放。按先前的研究将NS-PLL-ssDNA与h1299癌细胞孵育。ssDNA的5，末端被绿色荧光标记。2h孵育后，吸走培养基并用清水替代。一半的细胞不经历光触发，另一半光触发2.5W/cm2,2min。最后，固定细胞，细胞膜用红色染料染色。

17. 2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默 2.4基因治疗剂在体外降低绿色荧光蛋白的表达 Figure 3. Fluorescence images H1299 cells incubated withNS-PLL-ssDNA.

18. 2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默 2.4基因治疗剂在体外降低绿色荧光蛋白的表达 绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）。选择这两种荧光蛋白是因为它半衰期短，注射分子治疗剂后可以检测到它荧光强度的降低。 以GFP的含量来表征作GFP合成决定基因是否被反义寡核苷酸沉默 反义寡核苷酸有两种：采用化学修饰的单链反义DNA寡核苷酸（AON-GFP）或与GFP的mRNA互补的siRNA即siRNA-GFP。

19. 2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默 2.4基因治疗剂在体外降低绿色荧光蛋白的表达 通过设计SiRNA和反义寡核苷酸来降低GFP的表达但不影响RFP的表达。所有的测量GFP荧光吸收峰/RFP荧光吸收峰来表示 Figure 4. Downregulation of green fluorescent protein(GFP) in H1299 GFP/RFP cell line by antisense ssDNA and siRNA using nanoshell poly- L-lysine (NS-PLL) delivery vectors

20. 2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默 2.5细胞毒理实验（XTT实验） XTT钠盐：化学名：3,3'-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色产物。 当XTT钠盐与电子偶合剂（例如PMS）联合应用时，其所产生的水溶性的产物的吸光度与活细胞的数量成正比

21. 2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默2.金纳米作为载体运载寡核苷酸来使目标基因沉默 2.5细胞毒理实验（XTT实验） Figure 5. Analysis of NS-PLL nanoparticle-associated cyto-toxicity by XTT assay

22. 3.总结与展望 聚-L-赖氨酸（PLL）共价结合在金纳米球（NS）表面可以有效地捕捉寡核苷酸分子 金纳米负载的寡核苷酸可通过在800 nm的连续波近红外激光照射下来完成释放 寡核苷酸还以使人类癌症细胞H1299细胞系表达的绿色荧光蛋白（GFP）表达基因沉默 通过XTT细胞增殖实验可以证明NS-PLL和激光对细胞的毒性很小 NS-PLL可以用于基因治疗之中，但它还不是很完善，未来的研究之中，通过修饰一些特异集团，使得NS-PLL载体具有靶向性，提高其效率。

23. Thank You !