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实验十二 DNA 的连接与转化

实验十二 DNA 的连接与转化. 1. ＤＮＡ分子的体外连接 2．ＤＮＡ的转化及转化子的筛选. 一．实验目的及背景. 当我们已经获得目的基因片段，选择好适当的克隆（或表达，转化）质粒载体， 并确定重组方案后，下面要进行的就是ＤＮＡ片段之间的体外连接，从而获得重组子。 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因工程药物的生产），还可用于序列分析和转基因等重要生物技术的研究中。. 1 、ＤＮＡ分子的体外连接.

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实验十二 DNA 的连接与转化

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  1. 实验十二 DNA的连接与转化 1.ＤＮＡ分子的体外连接 2．ＤＮＡ的转化及转化子的筛选

  2. 一．实验目的及背景 • 当我们已经获得目的基因片段，选择好适当的克隆（或表达，转化）质粒载体， 并确定重组方案后，下面要进行的就是ＤＮＡ片段之间的体外连接，从而获得重组子。 • 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因工程药物的生产），还可用于序列分析和转基因等重要生物技术的研究中。

  3. 1、ＤＮＡ分子的体外连接 • ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下， 由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程， ＤＮＡ分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。

  4. 连接反应中值得注意的几个问题： • 1.ＤＮＡ连接酶 • 常用的ＤＮＡ连接酶有两种： (1)来自大肠杆菌的ＤＮＡ连接酶 (2)来自噬菌体的Ｔ４ＤＮＡ连接酶。 • 二者的作用机理类似。

  5. Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机制 • Ｔ４连接酶作用分三步： • １．Ｔ４ＤＮＡ连接酶与辅助因子ＡＴＰ形成酶－ＡＭＰ复合物。 • ２． 酶－ＡＭＰ复合物结合到具有５’－磷酸基和３’－羟基切口的ＤＮＡ上，使ＤＮＡ腺苷化。 • ３．产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来.

  6. 2.连接反应的温度 • ＤＮＡ连接酶的最适反应温度为３７℃， • 但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是１２℃过夜。

  7. 3. DNA的平未端和粘性末端 • 由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。 二者连接效率不同。 • 粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的，

  8. 4.碱性磷酸酶处理质粒载体 • 为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的浓度，增加重组子比例。这样就会出现ＤＮＡ自生连接问题， 为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。见下图。

  9. 5.连接反应的检测 • 连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确定。 • 我们下面的实验从粘性末端为例操作。

  10. 二、实验试剂 • １．纯化后的酶切质粒载体和目的基因。 • ２．１０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer • 200mM Tris-HCl(pH7.6) • 50mM MgCl2 • 50mM 二硫苄糖醇 • 500μl/ml BSA • ３．Ｔ４ＤＮＡ连接酶 • ４．5mM ATP

  11. 三．实验方法 • ＤＮＡ分子的体外连接 • １．在无菌Eppendorf管中加入以下溶液： • a. 0.1μg质粒载体，２倍分子的外源ＤＮＡ。 • b. 加无菌水至7.5μl，于４５℃加温５分钟使重新退火的粘端解链， 将混合物冷却到０℃。 • c. 加入： • １０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer 1μl • Ｔ４ＤＮＡ连接酶 0.1Weiss • 5mM ATP 1μl • ２．盖上管盖，充分混匀，台式离心扣上离心５秒。 • ３．１２℃下过夜连接反应。 • ４．反应结束后于－２０℃保存。

  12. 四．结果与分析 • 电泳检查连接结果 • １．如何判断连接效果的成功性？

  13. 问题与讨论： • １．简述Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机理。 • ２．简述一个完整外源ＤＮＡ的克隆过程。 • ３．连接反应中应注意些什么问题及如何提高连接效率。

  14. 2．ＤＮＡ的转化及转化子的筛选 • 一．实验目的及背景 • 体外通过基因工程手段所构建的含目的基因的重组质粒，选用转化和筛选技术， 可获得含重组的阳性克隆。在此阳性克隆中，ＤＮＡ可在生物体系中大量扩增，繁殖， 保存以及表达目的基因的产物，这是ＰＣＲ体外扩增ＤＮＡ所不能替代的。配合ＤＮＡ重组技术，所获得的，不同目的需要的阳性菌株已广泛应用于科研，医药生产和生物发酵等领域。

  15. 本实验由二个方面组成: • 1. 质粒ＤＮＡ转化大肠杆菌。 • 质粒转化不同细菌有不同的转化效率，转化效率的高低与实验的成败直接相关， 通常转化效率可达１０５－１０７转化子/μg DNA。 • 获得高转化效率的关键是感受态体菌的制备。

  16. 所谓感受态， 就是细菌吸收转化因子的生理状态。 • 关于感受态的本质与存在，说法很多， 目前主要有两种假说： １．局部原生质体化假说－－感受态细胞的表面形成一种能接受ＤＮＡ的酶位点， 使ＤＮＡ分子能进入细胞。

  17. 制备感受态细胞 • 现在制备感受态细胞通常用CaCl2处理，在低温中与外来ＤＮＡ分子相混合. • ＤＮＡ分子转化分以下几步: • １．吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面； • ２．转入－－双链ＤＮＡ分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解； • ３． 自稳－－外源质粒ＤＮＡ分子在细胞内复制成双链； • ４．表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译。

  18. 2.重组子的筛选 • 这和受体菌：质粒ＤＮＡ的选择相关， 原则上要注意： • １．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌株； • ２． 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原则而定。 • 重组子的筛选方法常用的有两种方法：

  19. １．抗生素筛选法 • 菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡拉霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。 • 本实验利用抗生筛选转化子。

  20. ２互补法 • 现在使用的许多载体（如ＰＵＣ系列）有含有一个大肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷酸基因（lacZ）的调控序列和头１４６个氨基酸偏码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。 • 受体菌则含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。当外源基因插入时，二者溶为一体后，有β－半乳糖苷酶表达， 在生色底物５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷（x-gal）培养基中形成兰色菌落。 • 而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。 通过颜色不同而区分重组子和非重组子。

  21. 二、实验试剂 • ＬＢ培养基 • 质粒ＤＮＡ（含Amp抗生基因），受体菌 • CaCl2 0.1M • Amp

  22. 三．实验方法 • 一、感受态细胞制备 • １．将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，３７℃培养１６～２０小时。 • ２．挑取单菌落转入２０ｍｌ ＬＢ培养基锥瓶中，３７℃振荡过夜。 • ３．从中取２ｍｌ菌液转入５０ｍｌ ＬＢ培养基中３７℃振荡培养４－５小时， 测ＯＤ１００达０．４～０．５。 • ４．培养物于冰上１０分钟。 • ５．转入－５０ｍｌ离心管，于４０００ｒｐｍ下４℃离心１０分钟。 • ６．弃上清，倒置离心管１分钟，流尽剩余残液然后加入10ml用冰预冷的 0. 1mol/L CaCl2，置冰上１０分钟。 • ７．4,000rpm 4℃离心１０分钟，弃上清。 • ８．加入2ml，0.1M CaCl2悬浮细胞，于４℃过夜。

  23. 二、转化 • １．在1.5ml Eppendorf管中加入２００μl感受态细胞和１０μl 40ng DNA溶液， 温和混匀，于冰上３０分钟。 • ２．于４２℃水浴９０秒。 • ３．冰浴２分钟。 • ４．加入８００μl ＬＢ 液体培养基３７℃ ４５分钟。 • ５．取２００μl涂布于含Amp(50μg/ml)琼脂糖平皿， ３７℃培养１２～１６小时，观察结果。

  24. 四．结果与分析讨论 • １．计算转化率。 • ２．根据转化率和阴性对照分析实验结果。 • 问题与讨论： • １．根据本实验认为影响转化率的因素有哪些？ • ２．抗性法筛选和互补筛选原理是什么？

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