1 / 10

Site directed mutagenezis

Site directed mutagenezis. Horváth Gergő. A site-directed mutagenezis (sdm) egy olyan molekuláris biológiai technológia melynek során a mutáció a DNS szakasz (általában plazmid ami a fehérjénket kódoló gént tartalmazza) egy előre meghatározott szakaszán történik meg.

naava
Download Presentation

Site directed mutagenezis

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Site directed mutagenezis Horváth Gergő

  2. A site-directed mutagenezis (sdm) egy olyan molekuláris biológiai technológia melynek során a mutáció a DNS szakasz (általában plazmid ami a fehérjénket kódoló gént tartalmazza) egy előre meghatározott szakaszán történik meg. • A technológia használatához szükséges a vad típusú gén szekvenciájának ismeretére. • Jelentősége: • egy adott fehérje szerkezete módosítható a fehérjét kódoló szekvencia módosításával.

  3. UDE - U-DNS specifikus nukleáz homológjait csak teljes átalakulással fejlődő rovarokban találták meg. -pl. a Drosophila melanogasterben a bebábozódás előtt fejeződik ki • Fémfüggetlen nukleáz (!)

  4. D. mel. ---------MIKCHMPSSWRRLRKISRILALTGSRQILTQVLATKGAAMAE-- 41 T. cas. ----------------------------------------------------- A. mel. -------------------------------------------------KSTE 4 D. pse. ------------------------------------------------MSE-- 3 A. aeg. ------------------------------------------------MSK-- 3 A. gam. -----------------------------------------------AMAK-- 4 B. mor. MLYKNERSVKLTIGRVDSDNRQKFSDRPIAQYASDFNVEVFIVLCFRTMGKDD 53 D. mel. -GDSKFGFKDMEKALETLKLLESHDMQYRKLTVRGLLGRAKRVLTMTKAEEKLKNINAAIGVFEKWLEEN 110 T. cas. ---------------------------------------------------------------------- A. mel. PEESVMGFKDKQKALDTLKALDGRDISYQYHVIASFVSRAKRTLQITRDEEKLANIREALKVFEDWLANY 74 D. pse. -GESKFGFKDMEKALETLKLLEDHDMQYRKLTVRGLLGRAKRVLTLTKAEEKLKNINEAIGVFEKWLEDN 72 A. aeg. -EESKYGFKDKAKAEESLELLKSEDHKYQVLTVRGLLGRAKRVLTLTKAEEKVKNIKEAIEVFENWIEEN 72 A. gam. -EESKYGFKDKAKAEESLELLKSEDHKYQLLTVRGLIGRAKRVLTLTKAEDKINNIKAAIETFEQWLEAN 73 B. mor. KEDTGFGFKDKAKAEDTLRLLEEHDLNYRRLTVRGLLGRAKRVLSVTKAEEKIKNIKEAMEVFENWLADL 123 D. mel. GGGASSKNAKT-ESEDKVE-----TVPGLGFKDKAAAEATLSILAERDPDYQRLAIKGLIGSSKRVLSGT 174 T. cas. ------------MSESKPD-----TVPGLGFKDKEKALETIKNLEGRDPDYQKLAIKGLIGRAKRTLTLT 53 A. mel. KENNRSKENLAYLPIETIKGFKSLAKNGLGFKDKEKALQTIKLLEGRDLNYQYHAISGLVKRAERVISCT 144 D. pse. GGGASSKNAKT-DNEDKVE-----TVPGLGFKDKAAAEATLSILAERDPDYQRLAIKGLIGSSKRVLSGT 136 A. aeg. SN-SSTKNAKPKESEEKVE-----TVAGLGFKDKEAAEKTLKILKGRDPDYQKLAIKGLLGSAKRVLPST 136 A. gam. SS-SSTKNAKPKDAEDKVE-----TVPGLGFKDKQAAEQTLSILEGRDPDYQKLAIKGLIGSAKRVIPAT 137 B. mor. DK-NKEQKEKP-EKKEKKD-----TVPGLGFKDKSAAEGTLKVLDGRDPDYQRLAVKGLIGRAKRVLTCT186 . ******* * *:. * ** :** *:.**: ::*.:. * D. mel. KNEDKITAIKEGVQVLEDFLEKFEAENRIKDNRAYLPLAVVTKLPD------PKDELAKEFLEAYGGSKA 239 T. cas.KDKEKLQNINDAMAVFDEWLNNFEKNGLTKENRAYLPLNAITALLPLKAQCKIEDSKCDAFYKAY--KGA 121 A. mel.KDEQKLKNIKEAVEVFDNWITDFKVNGRAKMNFDYLSVDLVRSYKPLADKYKIED---NGFLKAY--EEV 210 D. pse. KNEDKINSIKEGVQVLEDFLEKFEAENRIKENRAYLAYAVVSKLPE------PKEDLSVEFLAAYGGSKA 200 A. aeg. KNEDKIKSIKEAMETFEDFLETFDREERSKQNMAYLSLDLIKNLSD-----KPSDALAAEFVECY-DKVA 200 A. gam. KNEEKLSSIKQAVALFEDFLDRFDREERGKQNMPYLSIDLIRQLPAPQG--EQSDKLAVEFLACY-ETQA 204 B. mor. RDETKVSNIKEAITVFEKFLDDFESLHLSKENNPYLSLGVVRAAEQ------LAGESKTSFIAAY--SSV 248 ::: *: *::.: ::.:: *. * * **. : * .* . D. mel. KGNYKHLRTMFPKTDEKTSWDIVRNRQLSKLLEQIKSEEAKLFDAET---GAPTDLHLQLIHWAYSPQPD 306 T. cas. NGEYKNLRTVS-SGEDEPTWDIVRNTELKKLLKEIDEKKPDMWK-----DDLPTAEHLKLILWAYSPDAS 185 A. mel. DGDYKKLRNVQ-VPDSSITWDIERNKNLQNVVDRVKEQK-KWFETDGEFEDLPTEGHIRCIMWAYSHDAG 278 D. pse. KGNYKHLRTMYPKEDDTTSWDIVRNRQIAKLLEQIKSEEAKLFDSES---GEPTDLHLQLIHWAYTPQPD 267 A. aeg. KGNYKHLRTKFPKDDDSTSWDIVRNKKLLKLKETVKQNGEKLFDSD----GKPTKVHLEMIYWAYSPNVD 266 A. gam. KGNYKHLRTKAPKDPGSKTWDIVRNAKLQALKP---DSSVKLFDQD----GKPTELHLQMVQWAYSPQVE 267 B. mor. NGEYKRLRTVE-ESEGGLTWDIVRNNALKPLKAT-VHAEAKLFNEE----GEPTPEHLELILWAYSPEAA 312 .*:**.**. :*** ** : : : ** *:. : ***: : D. mel.KLKQYIEKLAKKTPEKRKQE----SSSSASDSSATSQDSDGEDKPKRKKKREE 355 T. cas.KIKKSVATFEEKLGSGDSKEDSDEDKSNKRKSGEGASSEESPTKKKKSD---- 234 A. mel.KLKKLLPTLAEKLKS-------------------------------------- 292 D. pse.KVKAYVEKLAKKTPQKRKPE--------------------------------- 287 A. aeg.KLKAYCTKLEKSSAKKRSHSSS--------ESDSESEDEVKDKKKSKK----- 306 A. gam.KLKSYANSLASSGKSTTPSRKRTHSSSSSSEQESKAKESKKDRKKSKK----- 315 B. mor.RLKKCLPEVETEVSRKRRS--------------SAQEESPAKKKKD------- 344 ::* . . 1.A motívum 1.B motívum 1.B motívum 2. m. 3. m. 4. motívum

  5. A fehérje felszín töltéseloszlása Kék: + Piros: - Feltételezett DNS kötő hely

  6. A konzervált régióban aminosav cserét eredményező pontmutációt terveztünk • A különböző, módosított fehérjék vizsgálatával meghatározható a katalitikus és DNS kötő hely is

  7. Mutánsok tervezése K(Lizin) A(Alanin) aag gcg (1A motívum) Primer a PCR-hez

  8. Kodon szótár

  9. PCR reakció Templát DNS a mutálni kívánt aminosavval Plazmid DNS denaturálása majd a kívánt mutációt tartalmazó oligonukleotid primerek kötődése (forward és reverse primer) A DNS polimeráz a replikáció során a kötődött primereket használja templátként A metilált nem mutált szülői szál emésztése Dpn1-el A plazmid transzformálása XL1-Blue E.Coli sejtekbe

  10. Köszönöm a figyelmet!

More Related