1 / 31

Szilárd fázisú peptidszintézis

Szilárd fázisú peptidszintézis. Bánóczi Zoltán MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport, Budapest. Peptidek és alkalmazásuk. Peptidek aminosavakból felépülő oligomerek. H 2 N-CH-CO-. H 2 N-CH-COOH. HN-CH-CO-. HN-CH-COOH. R. R. R. R. n. R: sok féle, 20 fehérjealkotó aminosav.

nairi
Download Presentation

Szilárd fázisú peptidszintézis

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Szilárd fázisú peptidszintézis Bánóczi Zoltán MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport, Budapest

  2. Peptidek és alkalmazásuk Peptidek aminosavakból felépülő oligomerek. H2N-CH-CO- H2N-CH-COOH HN-CH-CO- HN-CH-COOH R R R R n R: sok féle, 20 fehérjealkotó aminosav „A” és „Aaa” jelentése -HN-CH-CO- R Számos alkalmazás kutatás gyógyszeripar (Inzulin, Glukagon, Octreotide, Oxicotin) édesítőszer (aszpartám: Asp-Phe-OMe) szépségápolás (botox: Clostridium botulinum toxin)

  3. Peptidszintézis - kezdetek Emil Fischer: első peptidszintézis (1903) NH3 BrCH(R)COCl + H2N-CH(R’)CO2H BrCH(R)CONHCH(R’)CO2H H2NCH(R)CONHCH(R’)CO2H Bergmann és Zervas: Z-csoport (1932) Carpino: Boc-csoport (1957) Robert Bruce Merrifield: az első szilárdfázisú peptidszintézis (1963) Carpino: Fmoc-csoport (1972) J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 E. Atherton, R.C. Sheppard: Solid phase peptide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, England, 1989)Fmoc-technika

  4. Peptidszintézis - elv H2N-CH-COOH + H2N-CH-COOH R R’ -H2O Ezt szeretnénk! H2N-CH-CO- H2N-CH-CO- H2N-CH-CO- + HN-CH-COOH HN-CH-COOH + HN-CH-COOH R R R’ R R’ R és még sok minden más!!! Megoldás H2N-CH-COOH PG-HN-CH-CO-AG + H2N-CH-CO-OPG’ + PG-HN-CH-COOH R’ R R’ R -H2O -H2O PG-HN-CH-CO- HN-CH-COOH PG-HN-CH-CO- HN-CH-CO-OPG’ R R’ R R’ PG: védőcsoport AG: aktiváló csoport Oldallánc védőcsoportok!!

  5. Peptidszintézis - megvalósítás PG-HN-CH-COOH R PG-HN-CH-CO- HN-CH-CO-OPG’ + R H2N-CH-CO-OPG’ -H2O R’ R’ Hogyan? 1. Aktivált aminosav-származék ahol AG: - Cl - N3 - OCO-R’ - OR’ PG-HN-CH-CO-AG R 2. Közvetlen aktiválás - karbodiimid, DCC, DIC - in situ aktív észter képzés, DCC-HOBt, BOP-HOBt

  6. Peptidlánc felépítése 1. Stepwise (lépésenkénti) szintézis: PG-HN-CH-COOH R PG-HN-CH-CO- HN-CH-CO-OPG’ + R H2N-CH-CO-OPG’ -H2O R’ amino-védőcsoport eltávolítása R’ PG-HN-CH-CO- HN-CH-CO- H2N-CH-CO- HN-CH-CO-OPG’ HN-CH-CO-OPG’ R” R R R’ R’ -H2O + védőcsoportok eltávolítása 1 vagy 2 lépésben PG-HN-CH-COOH R” H2N-CH-CO- HN-CH-CO- HN-CH-CO-OH R” R R’ 2. Fragmenskondenzáció

  7. Miben más a szilárdfázisú peptid szintézis? 1. A C-terminális karboxil-csoport védelme a gyantával kialakított kötéssel. A kötés: - észter - amid R H2N-CH-CO- R’ 2. Az α-amino-csoport védőcsoportja eltávolítható a peptid-gyanta kötés hasadása nélkül. PG: - Boc - Fmoc R PG-HN-CH-CO- R’ 3. Funkciós csoportok védése az oldalláncokban.

  8. Gyantatípusok Gyanta: polisztirol-divinilbenzol kopolimer polimerizáció + Fmoc-technika Boc-technika Merrifield gyanta Wang gyanta MBHA gyanta Klórtritil gyanta Rink amid-MBHA gyanta

  9. Első aminosav kapcsolása a gyantához MBHA és Rink amid-MBHA, akár a többi aminosavat Merrifield gyanta Boc-Aaa(X)-OCs DMF, 50 °C, 48 h Boc-HN-CH-CO-O R’(X) Wang gyanta: Fmoc-Aaa(X)-OH + DIC + DMAP H2N-CH-CO- R’ Klórtritil gyanta: Fmoc-Aaa(X)-OH + DIEA H2N-CH-CO-O R’

  10. Peptidlánc felépítése In situ aktivészteres kapcsolás Boc-technika DCC HOBt Fmoc-technika DIC HOBt Aminosav származék és kapcsolószerek nagy feleslegben (3 ek.≤)

  11. Funkciós csoportok az oldalláncban Boc-technika Lys Arg Asp, Glu Cys Ser, Thr, Tyr His 2-Cl-Z Tos OBzl OcHex Meb Tyr Bzl 2-Br-Z Dnp

  12. Fmoc-technika Lys Arg Asp, Glu Cys Ser, Thr, Tyr His Boc Pbf (2,2,4,6,7-pentametil- dihidrobenzofurán- 6-szulfonil) OtBu Trt tBu Bum

  13. Ideiglenes védőcsoport hasítása Boc-technika R HN-CH-CO- R’(X) TFA/DCM +H3N-CH-CO- R + CO2 + R’(X) Fmoc-technika R HN-CH-CO- R’(X) piperidin/DMF H2N-CH-CO- + CO2 + R R’(X)

  14. Boc-technika szintézis protokollja • Gyanta mosása 3-szor DCM-nal; 0,5-1,0 perc • Boc-csoport hasítása 33% TFA/DCM; 2+20 perc • Gyanta mosása 5-ször DCM-nal; 0,5-1,0 perc • Semlegesítés 3-4-szer 5-10% DIEA/DCM; 1 perc • Gyanta mosása 4-szer DCM-nal; 0,5-1,0 perc • Kapcsolás: Boc-aminosav származék-DCC-HOBt DCM-DMF elegyben • (3 ekv. A gyanta kapacitásához képest); 60 perc • Gyanta mosása 2-szer DMF-dal; 0,5-1,0 perc • Gyanta mosása 2-szer DMF-dal; 0,5-1,0 perc • Ninhidrin (izatin) teszt (-) sárga (+) kék

  15. Fmoc-technika szintézis protokollja (-) sárga • Gyanta mosása 3-szor DMF-dal; 0,5-1,0 perc • Fmoc-csoport hasítása • 2% piperidin + 2% DBU/DMF; 2+2+5+10 perc • Gyanta mosása 8-szor DMF-dal; 0,5-1,0 perc • Kapcsolás: Fmoc-aminosav származék-DIC-HOBt DMF-ban • (3 ekv. A gyanta kapacitásához képest); 60 perc • Gyanta mosása 2-szer DMF-dal; 0,5-1,0 perc • Gyanta mosása 2-szer DCM-nal; 0,5-1,0 perc • Ninhidrin (izatin) teszt (+) kék

  16. O OH O N + NH2-R 2 O H O H O O kék λ(570nm) O OH Pro esetén: O + N Nincs különbség a termék és a ninhidrin színe között O O- O sárga O NH Ninhidrin teszt • Teszt oldatok: • 40 g fenol 10 mL abs. EtOH-ban • 65 mg KCN 100 mL deszt. vízben (2 mL-t higítunk 98 mL piridin-nel) • 2,5 g ninhidrin 50 mL abs. EtOH-ban Izatin test: 3% izatin + 5% Boc-Phe-OH benzilalkoholban + ninhidrin teszt oldatok A gyanta színe vörös-fekete

  17. nem Peptid (védőcsoportok) hasítása gyantáról Boc-technika Van a peptidben His(Dnp)? igen Dnp hasítása (tiofenol:DIEA:DMF 3:3:4 (V/V/V)) Van N-terminális Boc-csoport? igen nem Boc-csoport hasítása A peptid (védőcsoportok) kompatibilisek HF, TMSOTf, TFMSA? HF TFMSA TMSOTf Anizole, p-kresol és DTT 10% TFMSA- 10% tioanizol-TFA EDT és m-krezol jelenlétében 1 M TMSOTf-tioanizol/TFA oldat melyben m-krezol és EDT

  18. nem Fmoc-technika Van N-terminális Fmoc-csoport? igen Fmoc hasítás Van a peptidben Arg, Met, Trp vagy Trt? yes nem Van a peptidben Arg, Met? „A” hasítási elegy nem igen B: 0,75 g fenol 0,25 mL EDT 0,50 mL tioanizol 0,50 mL deszt. víz 10 mL TFA Van a peptidben Trp vagy Trt? „B” hasítási elegy igen nem „C” hasítási elegy C: 0,25 mL EDT 0,25 mL deszt. víz 9,50 mL TFA A: 0,5 mL deszt. víz 9,5 mL TFA

  19. Peptid tisztítása és jellemzése Valamennyi izolálás liofilizálással történik. Nyers peptidet RP-HPLC-val tisztítjuk. • A peptid analitikai jellemzése: • - analitikai RP-HPLC • - tömegspektrométria

  20. Miért jó a kémiai peptidszintézis? Gén-technológianépszerű, viszonylag olcsó és egyszerű, de csak hosszabb lineáris fehérjék felépítésére alkalmas L-aminosavakból. • De nem lehet: • D-aminosavak • nem természetes aminosavak • poszt transzlációs módosítások(Hyp, Pyr, gliko- ésfoszfopeptidek) • nem lehet elágazó láncú vagy • ciklikus peptid • fluoreszcens vagy izotóp jelölt peptid

  21. Nem természetes aminosavak

  22. https://www.peptechcorp.com/documents/Unnatural_amino_acids_in_drug_discovery.pdfhttps://www.peptechcorp.com/documents/Unnatural_amino_acids_in_drug_discovery.pdf

  23. Glikopeptidek T. Buskas et al. Glycobiology, 16, 113R–136R, 2006

  24. Elágazó láncú peptidek Hordozó peptidek: H-FRHDSHYX5C-NH2 S-CH2CO-K(S-CH2CO) H-FRHDSHYX5C-NH2 KRRbA-NH2 X=Ø (25, MAP(Ab4-10C)4) H-FRHDSHYX5C-NH2 S-CH2CO-K(S-CH2CO) H-FRHDSHYX5C-NH2 Mező, G., Manea, M. et al. J. Peptide Science 10, 701 (2004) Dendrimer szerkezetű sejtpenetráló oligoargininek vázlatos szerkezete Futaki, S., et al.Biochemistry 41, 7925–7930 (2002)

  25. Ciklikus peptidek • Természetes anyagok; antibiotikumok, hormonok, toxinok • Térszerkezet rögzítése • Enzimstabilitás növelése A) Csak amid kötést tartalmaz - fej-farok - oldallánc is érintett B) diszulfid híd, tioéterkötés, észter (lakton), éter, oxim, tiazolidin … stb.

  26. HO O O O O O- O Na+ N N H2 H S S N N H H O O Fluoreszcensen jelölt peptidek • Molekulák nyomon követése – számos jelzőmolekula elérhető. lex = 360 nm lem= 480 nm lex.= 490 nm lem.= 520 nm 5-karboxifluoreszcein (Flu) 4-(7-hidroxikumaril)-ecetsav (Hca) lex.= 320 nm lem.= 480 nm 5-[(2-aminoetil)amino]napftalin-1-szulfonsav (EDANS)

  27. Hca-RQIKIWFQQNRRMKWKKC-NH2 S S Ac-CSK(Flu)PIGPDDAIDALSSDFTS-NH2

  28. Hca-RQIKIWFQNRRMKWKKC-NH2 S-CH2CO-SKPIGPDDAIDALSSDFTS-NH2 H-RQIKIWFQQNRRMKWKKSGKSGMDAALDDLIDTLGG-NH2 A) HcaPenKalpA amid B) HcaPenKalpC tioéter C) HcaPenKalpC tioéter

  29. Emésztés előtt Emésztés után 40 35 30 25 Int. cszubsztrát= 200 mM. , cKalpainB= 0,5 µM lgerj.=320 nm, lem.= 480 nm F 20 O O 15 O O 10 O- O H H C C N N Na+ 3 3 5 N N H H S S 0 TPLKSPPPSPR N N N N N N H H N N H H 350 400 450 500 550 600 650 O O (nm) lgerj. H H C C 3 3 DABCYL EDANS 2. FRET (fluorescence resonance energy transfer) DABCYL-TPLKSPPPSPRE(EDANS)RRRRRRR-NH2

  30. Hipocampus szöveteket 5 percig kezeltünk a sejtpenetráló szubsztrát oldatával (c=50 mM). • Hipocampus szöveteket kezeltünk 5 percig a sejtpenetráló szubsztrát oldatával (c=50 mM), majd kalpasztatin A és C konjugátumot adtunk az elegyhez (c=5 μM)és a kezelést további 15 percig folytatuk. Piramidálissejtek régiója (üres nyilak) és más régiók (tele nyilak).

  31. Házi feladat Hogyan állítana elő védetlen peptidet a következő származékból? Mi keletkezik a folyamat végén? (Több lépés is lehetséges!) Fmoc-Ala-Lys(2ClZ)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-O

More Related