研究室の紹介

1. 研究室の紹介　

2. Recent progress in aquaporin research • 発現制御 (expression)　分子種間 (among genes) 　部位/分化特異性 (tissue/development specific) 　 環境ストレス応答性 (stress response)　形質転換系 (transgenic) • 活性制御 (activity)　リン酸化 (phosphorylation)分子間相互作用 (intermolecular interaction)細胞内輸送 (cellular trafficking) • 個体形質との関連 (phenotype)

3. 発現制御　Expression (Normalize to control (0 mM NaCl)) 1010 (control) 109 108 オオムギ根でのPIPアクアポリン１0種のmRNA量 107 106 (100mMNaCl) 109 Amount of transcript (copies/µg total RNA) 108 107 106 (200mMNaCl) 109 108 107 106 105 HvPIP2;1 HvPIP2;2 HvPIP2;3 HvPIP2;4 HvPIP2;5 HvPIP1;1 HvPIP1;2 HvPIP1;3 HvPIP1;4 HvPIP1;5 Mild (100 mM) stress → No changes Severe (200 mM) stress → Mostly decrease var. Haruna-nijyo (salt tolerance: middle) 5-day old seedlings (PCP 52:663)

4. However, in root hydraulic conductivity (Lpr) … （根水透過性） Salt tolerant var. K305 Salt sensitive var. I743 (4 hr after salt stress) Pressure chamber Sap flow: Jv Jv /A = Lpr (ψp - Y) A : total root surface area ψp: applied pressure Y : Yielding pressure 発現量の多いPIPや発現変動が大きいPIP 　　・・・品種間で一致する傾向 全体的に塩感受異性品種で発現が多い (SSPN 57:50)

5. 33種類のイネアクアポリン　プロファイル （東北農研他） 全ての器官に存在(>105 copies/ μg total RNA) 鱗被,　花糸、節間成熟部位 節、節間成熟部位 根に特異的 葉に特異的 葯に特異的 どの器官でも発現していない。 登熟中の種子に特異的 RiceXPro http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/における　OsMIPfamilyの発現　→　例

6. シロイヌナズナPIP　（資源植物科学研究所・森先生と）シロイヌナズナPIP　（資源植物科学研究所・森先生と） シロイヌナズナ孔辺細胞で発現が多いPIPの同定 AtPIP2;2, 2;3, 2;5, 2;8 遺伝子破壊株の気孔運動解析 (明所　→　暗所　での気孔閉鎖の時間経過) （ΔPIP2;3） （ΔPIP2;8） （ΔPIP2;5） ΔPIP2;3とΔPIP2;5：　暗誘導閉口に関係ない　　ΔPIP2;8：　閉鎖が早い（理由解析中）

7. トマトアクアポリン　（名大：白武先生の研究）トマトアクアポリン　（名大：白武先生の研究） RT-PCR TIP 8種 XIP 2種 NIP 8種 PIP 9種 SIP 2種 トマトに新規AQP XIP ２種発見 若い果実で多く発現するもの SiPIP2;3, 2;5など 合計２５種

8. アクアポリンタンパクの発現（組織/細胞内）アクアポリンタンパクの発現（組織/細胞内） Indirect immunofluorescense (間接蛍光抗体法) Alexa 647 (red) conjugated anti-rat IgG goat antibody Alexa 488 (green) conjugated anti-rabbit IgG goat antibody Anti-HvPIP1s rat antibody (IgG)(common among HvPIP1s) Anti-HvPIP2;1 (or 2;2) rabbit antibody (IgG) (specific to each molecular species) HvPIP2s HvPIP1s

9. (明視野) (抗PIP1s抗体) 内皮 根毛 中心中 皮層 後生木部 表皮 (抗PIP2;2抗体) (Overlay) （PCP52：663）

10. （イネPIPの発現部位）　免疫染色　（東北農研）（イネPIPの発現部位）　免疫染色　（東北農研） AtSIPタンパクの細胞内局在　 　　　　　　　　→　ER 　免疫前血清Anti-OsPIP2;1 Anti-OsPIP2;5 OsPIP2;1、OsPIP2;5は、根の内皮細胞の内側（向心側）に多く局在する 免疫電顕　（秋田県立大学） OsPIP1;3(根)OsPIP1;3(根)OsPIP1;1(根) 一次抗体：anti-Kar2 (Bip)、anti-SIP1s 二次：anti-(rabbit IgG) linked with Alexa488 OsPIP1;1、OsPIP1;3とも細胞内で原形質膜近傍とER膜近傍で検出 免疫染色　（名大・前島先生） 免疫染色・・・もとは免疫組織化学（化学発色または発光）が多かったが、現在は蛍光抗体が主流 免疫電顕・・・抗体につなげた金粒子を電顕で検出

11. 環境ストレス応答性　（Stress response) 冠水適応に関与するOsTIPsの同定 （浮イネ　Deepwater rice) 名大 根での発現におよぼす地上部の影響（イネ）　東北農研 （×106 copies mRNA/μg total RNA） 140 120 100 80 60 40 20 0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 OsPIP2;5mRNA Dry (RH=40～50%) Humid (RH=90%) Ep アクアポリン発現量 蒸散要求量Ep（W m-2) 12 冠水　　　　　　　　　節間成長 　→　→　→　 OsPIP2;1 10 OsPIP2;5 （６～８月）12 16 19 23 24 7 16 19 20 21 22 28 30 31 2 3 4 5 6 7 8 10 11日 　↓　　　　　　　　　　　　↑ ＴＩＰ発現上昇　→　細胞伸長 8 mRNA amounts (x 106 copies / 1μg total RNA) mRNA amounts (x 106 copies / 1μg total RNA) 6 4 2.0 1.5 1.0 0.5 0 OsTIP1:1 2 0 -11 0 2 4 6 8 -11 0 2 4 6 8 光に反応するように見えが 実は蒸散要求（湿度）に応答 Relative protein amount 2.0 1.5 1.0 0.5 0 2.0 1.5 1.0 0.5 0 OsTIP2;2 全冠水 半冠水 非冠水 全冠水 半冠水 非冠水 1日　　　　　　３日 タンパク量

12. So:Chilling tolerant rice Wa:Chilliing senxsitive rice 25℃　　→　４℃　　→　２５℃（Recovery）　 低温ストレス応答　（イネアクアポリン） 低温 Chilling 　（秋田県大） 温度応答性（Temperature) 高温 High temperature　（名大） イネＰIP１；３は低温耐性と関連 シロイヌナズナPIP2;3は高温に応答する

13. イネ　（春季の低水温） 低温で根の吸水量が減り、しおれる植物の事例 ソラマメ 地上部5ºC5ºC Shoot 地下部25ºC5ºC Root →　アクアポリンの機能と発現量が低温（冷温）によって低下する

14. アクアポリンあたりの活性が下がる　→　どう対応するか？アクアポリンあたりの活性が下がる　→　どう対応するか？ アクアポリンの数を増やして、細胞あたりの活性を維持する (耐寒性Figleaf Gourd（クロダネカボチャ）の場合） Days at low temp. Days at low temp. アクアポリン タンパクの量 (Western blotting) Chilling sensitive Chilling tolerant イネの吸水障害を克服する一つの方法 　軽い脱水処理（浸透圧処理）　→　アクアポリンの発現量上昇　→　低温条件下での、吸水量低下が軽減　→　耐冷性強化

15. 水輸送活性の制御　 リン酸化Phosphprylation・・・活性化 リン酸化サイトアミノ酸の置換 Substitution 抗リン酸化抗体によるリン酸化の検出 （名大） 0.4 0.3 0.2 水透過係数　Pf ( 10-2 cm/s)‏ 果実肥大（吸水）時にリン酸化↑ Fruit riping 0.1 0.8 0.6 リン酸化阻害剤 Sutaurosporine (kinase inhibitor) 根の水透過性Lpｒとリン酸化（オオムギ） LPr [10-6 ms-1 MPa-1] 0.4 0 0.2 根の水透過性はリン酸化を阻害すると阻害される 0 Water AlaAla AspAla AlaAsp AspAsp PcPIP2:2 (SerSer) アミノ酸置換

16. Oocyte swelling assay チューリップ 開花時にもリン酸化↑ Flowering アサガオ Kinase inhibitor 抗リン酸化抗体 抗PIP（全体）抗体 • 低温→高温で開花 • 花の細胞（特に花下部の細胞）が吸水 • 原形質型アクアポリン・・・恒常的発現 • 低温→高温でアクアポリンのリン酸化 • 　 　（リン酸化されて、水輸送活性上昇） • 朝の開花前に活性化

17. 分子間相互作用　heteromerization (First reported in Maize, Plant Cell 16:215. 2004) (ここではオオムギでの研究結果を示す) HvPIPsSingle injection HvPIP2s (2;1~ 2;5) 活性あり Relative volume HvPIP1;2 or other HvPIP1s and negative control 活性なし Time (sec) Co-injection of HvPIP１s and HvPIP２s （水透過性） 活性化 RNAインジェクション量 Pf：吸水グラフの傾き（吸水速度）から算出する水透過性

18. 分子種間相互作用の分子機構　・・・　キメラ分子の作成　→　N末が相互作用部位分子種間相互作用の分子機構　・・・　キメラ分子の作成　→　N末が相互作用部位 N末 １型 ２型 HvPIP1s とHvPIP2sの共発現　→　活性化(Hetermelization) HvPIP1;x HvPIP2;x HvPIP2;x HvPIP1;x Pf( x 10-2 cm/s)

19. ┏ 検出用蛍光標識抗体 ┓ Fluorescence antibodies Co-expression of HvPIP1;2 and HvPIP2;4 activated each others by two means: Translocation to the plasmamembrane Direct activation 抗HvPIP2;4抗体 抗HvPIP1s抗体 PIP2;4 PIP1;2 Single expression PIP1;2 PIP1;2 PIP2;4 PIP2;4 Co-expression HvPIP2;4-injection HvPIP1;2-injection PIP1はPIP2と共に膜へ移行して機能する Inactive HvPIP2;1 T229M can activate PIP2;1 via heteromerization

20. Inactive HvPIP2;4 T229M can activate PIP1;2 via heteromerization Inactive HvPIP1;2 T238M can activate PIP2;4 via heteromerization PIP2;4(2 ng) + PIP1;2T238M (10 ng) PIP2;4T229M----Thr229isreplacedbyMet. < Loss of water transport activity> PIP1;2T238M----Thr238isreplacedbyMet. < Loss of water transport activity>

21. 活性調節機構 （共発現／分子種間相互作用） 表皮 皮層 内皮 H2O イネプロトプラスト 相互作を蛍光で検出 （秋田県大） 道管 <Apoplastic or Symplastic > Root hair 植物組織（オオムギ根:前出） 主にPIP2s （HvPIP2;2) 主にPIP1s PIP1とPIP2が共発現 分子間相互作用による活性制御を組織ごとに使い分けている可能性

22. 水輸送活性の調節　Internalization/Recycling Barley Lpr after 100 mM NaCl (Time course) Salt tolerance: low Salt tolerance: middle Salt tolerance: high Rice (Nipponbare) Lpr after 100 mM NaCl No reduction of Lpr

23. Root hydraulic conductance (Lpr) is regulated by phosphorylation and possible trafficking of aquaporins in early phase of salt/osmotic stress Lpr of Haruna-nijo after salt (100 mM NaCl) or osmotic (177 mM sorbitol) stress Isotonic sorbitol induced identical Lpr change (mM) (mM) (μM) (μM) (mM) (mM) (μM) Protein-phosphatase inhibitor (Okadaic acid; OA) and enodcytosis inhibitor (wortmannin: wm) inhibit salt-induce Lpr reduction at 1 h after stress

24. Root hydraulic conductance (Lpr) is regulated by phosphorylation and possible trafficking of aquaporins in early phase of salt/osmotic stress Lpr of Haruna-nijo after salt (100 mM NaCl) or osmotic (177 mM sorbitol) stress Exocytosis inhibitor (brefeldin A : BFA ) inhibits temporal recovery of Lpr at 4 h after stress

25. Root hydraulic conductance (Lpr) is regulated by phosphorylation and possible trafficking of aquaporins in early phase of salt/osmotic stress Lpr of Haruna-nijo after salt (100 mM NaCl) or osmotic (177 mM sorbitol) stress Proteasome inhibitor (MG132 ) inhibits reduction of Lpr after stress > 4 h

26. Barley Lpr after 100 mM NaCl otisotonic sorbitol/manitol リン酸化、細胞内局在、タンパク質合成／分解が水透過性の浸透圧ストレス応答に関与している

27. Model Salinity (Osmotic) stress Non-stress Osmotic stress signal H2O PIP aquaporin MG132 P P WM BFA OA （<4h） Severe stress Transient Pool （>200mM NaCl） Mild stress （>4h） Activated Protein degradation mRNA & Protein degradation

28. 100 mM NaCl Standard sol. 45 min Early Effects of Salinity on Water Transport in Arabidopsis Roots. Molecular and Cellular Features of Aquaporin Expression. Boursiac et al. Plant Physiology (2005)139:790 120 min 原形質膜マーカー タンパク GFP-LTP PIP1;1-GFP PIP2;1-GFP Stimulus-induced downregulation of root water transport involves reactive oxygen species-activated cell signalling and plasma membrane intrinsic protein internalization. Boursiac et al. The Plant Journal (2008) 56, 207–218

29. Fluorescence recovery after photobleaching reveals high cycling dynamics of plasma membrane aquaporins in Arabidopsis roots under salt stress. Luu et al. Plant Journal （2012）69:894

30. Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the SNARE SYP121. Plant Cell （2012）24: 3463 CFP or FM4-64 YFP merge mYFP:ZmPIP2;5 FM4-64 mYFP:ZmPIP2;5 mCFP:PMA2(PM marker) Co-expression mYFP:ZmPIP2;5 mCFP::AtSYP121-Sp2 （変異AtSYP121) Co-expression SNARE: Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor

31. Nature Cell Biology 14(10), 991-998 (2012) • Background • Aquaporin determines Lpr. • Total root water uptake depends on root architecture and amount (including root hair). • Auxin changes root formation. • How about relationship between PIPs and Auxin? Nature 446, 621-622(2007) Auxin response factor (ARF) proteins function as transcription factors controlling auxin-responsive genes. ARF7 plays a key role during lateral root formation and emergence. arf7: loss-of-functionmutant ARF7

32. Bending induced lateral root formation Most PIPs decreased after bending. AtPIPsの発現量

33. Bending PIP amounts water relations Auxin Receptor mutant (arf7)

34. Lpr-h: Root hydraulic conductivity (root pressure chamber) Lpr-o: Root osmotic conductivity (natural sap exudation) Lpcell: Cell hydraulic conductivity (cell pressure chamber) T1/2,Turgor, Ep

35. GUS・・・PIP2;1 transcript accumulation mCHERRY・・・PIP2;1 protien accumulation mirror image to Auxin accumulation IAA reduced PIP2;1 expression and induce lateral root formation Auxin inhibitor increased PIP2;1 expression and reduced lateral root formation

38. 形質転換体 水輸送との関係 Transgenic rice * Expression analysis <qRT-PCR> (WT: Nipponbare 24-day old) Absolutequantification Root specific Internal standarads: eEF-1α：Eukaryotic elongation factor 1-alpha UBC：Ubiquitin-conjugating enzyme E2 • Mutant lines of OsPIP2;4 • Overexpression • Antisense • T-DNA (POSTECH, Korea) Acknowledgement: The vector for the transgenic rice plants were kindly provided by Dr. Ichikawa (NIAS) and Dr. Horiguchi (NIBB).

39. Total OsPIP mRNAs in roots and Lpr in OsPIP2;4 overexpressor VS. WT Lpr * OsPIP2;4 P＜0.05 * NOTE: Less increases of total OsPIP mRNAs.

40. Expressions of OsPIPs in roots of OsPIP2;4transgenic lines Root specificity PIP1;1 PIP1;2 PIP1;3 PIP2;1 PIP2;2 PIP2;3 PIP2;4 PIP2;5 PIP2;6 PIP2;7 PIP2;8 eEF-1α UBC x6.4 P＜0.05 P＜0.001 Total mRNAsin the T-DNA line (root) 96% OsPIP2;4 PIP2;4 OE PIP2;4 T-DNA Other PIPs OsPIP2;4 Wt Other PIPs Compensative change against OsPIP2;4 mRNA.

41. Up-regulation （P＜0.05） Down-regulation（P＜0.05） • Expression of root specific OsPIPs were co-regulated with OsPIP2;4. Simultaneous down-regulation under osmotic stress. Compensative regulation against OsPIP2;4 in transgenic lines.

42. Up-regulation （P＜0.05） Down-regulation（P＜0.05） • Expression of root specific OsPIPs were co-regulated with OsPIP2;4. OsPIP1;3 may compensate OsPIP2;4 activity partially. Co-expression increased the activity in oocyte system. (Modified after Matsumoto et al. PCP 50:216 (2009))