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兔肝 DNA 的提取

一般性实验 -6. 兔肝 DNA 的提取. 实验目的 学习从动物组织中提取 DNA 及其含量、纯度测定的原理和方法 掌握离心机及岛津 UV-120 的使用方法. 实验原理. 利用脱氧核糖核酸蛋白和核糖核酸在电解质中不同的溶解度使二者分离，在 0.15M 的氯化钠溶液中脱氧核糖核酸蛋白的溶解度最低。相反，核糖核蛋白能在 0.15M 氯化钠中溶解，因此可利用不同浓度的氯化钠溶液将核酸核蛋白、脱氧核糖核酸蛋白解离出来，而蛋白质变性沉淀，再用氯仿－异丙醇抽提，将蛋白质沉淀除去，而 DNA 则溶解。. 1. 弃上清留沉淀. 离 心. 兔肝. 加至 8ml 1X SSC.

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兔肝 DNA 的提取

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Presentation Transcript

  1. 一般性实验-6 兔肝DNA的提取

  2. 实验目的 • 学习从动物组织中提取DNA及其含量、纯度测定的原理和方法 • 掌握离心机及岛津UV-120的使用方法

  3. 实验原理 利用脱氧核糖核酸蛋白和核糖核酸在电解质中不同的溶解度使二者分离，在0.15M的氯化钠溶液中脱氧核糖核酸蛋白的溶解度最低。相反，核糖核蛋白能在0.15M氯化钠中溶解，因此可利用不同浓度的氯化钠溶液将核酸核蛋白、脱氧核糖核酸蛋白解离出来，而蛋白质变性沉淀，再用氯仿－异丙醇抽提，将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解。

  4. 1. 弃上清留沉淀 离 心 兔肝 加至8ml 1X SSC 3.弃上清留沉淀 （脱氧核糖核蛋白） 1X SSC洗 两次 称取4 g 加 8ml 1X SSC 离 心 匀浆、过滤 2.弃上清留沉淀 取8ml匀浆液 离 心 加至 8ml 0.15M NaCl-0.1M Na2EDTA 实验操作

  5. 加约2倍 体积 95% 乙醇 沉淀 等体积氯仿-异丙醇混合液 加 0.15M NaCl-0.1M Na2EDTA至4ml DNA析出 加塞反复 倒置抽提 10min 重复 一次 轻搅 10min 用玻棒挑出 逐滴加入0.5ml 15% SDS 挑取DNA至一离 心管(小烧杯)用10ml 0.01N NaOH溶解 搅拌10min 去塞！离心 加1ml 5M NaCl 吸取上清液 勿吸到中间层！

  6. 注意事项 • 尽可能避免DNA的断裂 1. 匀浆时应保持低温，且匀浆时间应短； 2. 实验中使用的吸取DNA水溶液的滴管口应粗短并成钝口。 • 保持DNA活性，避免酸碱或其他变性因素使DNA变性。 • 搅动不要太大，以免使DNA断裂。 • 整个实验过程应在低温条件下进行。 • 搅拌时动作要轻，反复倒置抽提，不可激烈振荡。

  7. 加入15% SDS时要慢，边搅边滴加（两人配合）。 • SDS的温度不能太低，易凝固。吸过SDS的吸管要及时清洗。 • 加入CHCl3/IAA液离心后，分为三层，由上到下为：无机相-蛋白相-有机相。DNA溶解在无机相中，吸取无机相时动作要轻，不要吸到蛋白相。 • CHCl3/IAA会溶解有机玻璃，用完后不能竖直放置在试管架上，必须冲洗干净。

  8. 离心机的使用 • 打开电源开关； • 平衡放置离心管；盖上盖子。 • 调节时间旋钮至10min； • 缓慢调节速度旋钮至9档，每5-10s上升1档； • 离心完毕后机器自动停止，待完全停止后，打开盖子取出离心管。 • 离心管必须平衡后，才能启动离心机； • 离心机的盖子必须盖紧； • 离心过程中不要用重物撞击离心机； • 要等离心机完全停止转动后再打开盖子。

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