Acta Pharmacologica Sinica 2006 May; 27 (5): 603–608

1. Acta Pharmacologica Sinica 2006 May; 27 (5): 603–608

2. Sülfasalazin deneysel testiküler torsiyon/detorsiyon sonrası spermatojenik hücrelerde gelişen apopitozu önler. DR ECE MİNE DEMİR ADÜ BİYOKİMYA AD

3. GİRİŞ

4. Spermatik kord torsiyonu olarak tanımlanan testis torsiyonu, 25 yaş altı erkeklerde 1:4000 oranında görülen önemli bir tıbbi durumdur. • Eğer testis torsiyonu oluştuktan 4-6 saat arasında tedavi edilmezse spermatojenik hücrelerde hasar meydana gelir. • Bu zaman aralığında testis cerrahi olarak detorsiyone hale getirilse bile ipsilateral testiste kalıcı hasar gelişebilir. • Torsiyon/detorsiyonu takiben gelişen iskemi/reperfüzyon sonucunda testiste anlamlı patolojik değişiklikler meydana gelir.

5. Sülfasalazin 1942 yılında antibiyotik (sülfopiridin) ve antienflamatuar (5-aminosalisilik asid) ilaç kombinasyonu olarak üretilmiştir. • Sülfasalazin I kappa B(lкB)’nin fosforilasyonunu inhibe ederek nükleer faktör kappa B(NF-кB)’nin inhibitörü olarak görev yapar. • Böylece nükleusa translokasyonu önlenir ve adezyon moleküllerinin ekspresyonu azalır.

6. Yapılan bu çalışmada amaç: Deneysel testis torsiyonu sonrası sülfasalazinin spermatojenik epitelde NF-кB’nin aktivasyonunu ve spermatojenik hücrelerde apopitozu önlediğini göstermektir.

7. MATERYAL-METOD

8. Deney hayvanları: Sprague-Dawley cinsi 32 genç erişkin erkek rat (240-280g) kullanıldı (Wuhan Üniversitesi Tıp Fakültesi Deney Hayvanları Merkezi). • Ratlar 5-6 kafese konup standart şartlarda yaşamaları sağlandı. • Her grupta 8 rat olacak şekilde 4 gruba ayrıldılar. • Tüm ilaç ve kimyasallar SİGMA’dan temin edildi. • Sülfosalazin: 350mg/kg dozunda 15 mL %0,9 sodyum klorür (SASP) içinde çözündürülerek intraperitoneal(İP) enjeksiyonla verildi.

9. Deneysel testiküler torsiyon: Hayvanlara intraperitoneal sodyum pentobarbital(50 mg/kg) uygulanarak cerrahi işlem ve testiküler iskemi gerçekleştirildi. • A ve B gruplarındaki hayvanların sol testisleri 720° longitudinal axis boyunca döndürüldü ve 2 saat boyunca torsiyone olarak bırakıldı. • Torsiyon sonrası ters rotasyon yapıldı, testis skrotum içine yerleştirildi ve yeniden testise kan akımı sağlandı. • A grubuna(T+SASP): SASP solüsyonu kesiyi kapatmadan hemen önce İP olarak verildi. • Hayvanlar 5saat sonra İP olarak SASP solüsyonu uygulandı ve bu her 24 saat tekrar edildi.

10. B grubu(T+SC) : A grubu gibi tedavi grubuydu. • Testis torsiyonu A grubu gibi uygulandı ve SASP solüsyonu yerine 15 mL %0,9’luk sodyum klorür verildi. • C ve D gruplarına tesis torsiyonu hariç diğer gruplara uygulanan tüm cerrahi işlemler uygulandı. • C grubuna(SC) kesiyi kapatmadan hemen önce İP 15 mL %0,9’luk sodyum klorür verildi. • Bu işlemden 5 saat sonra ve her 24 saat sonrasında İP %0,9’luk sodyum klorür verildi.

11. D grubuna(SASP) kesiyi kapatmadan hemen önce İP SASP solüsyonu verildi. • Bu işlemden 5 saat sonra ve her 24 saat sonrasında İP SASP solüsyonu verildi. • Tüm hayvanlar detorsiyondan 72 saat sonra öldürüldü.

12. Western Blot (WB): • Testisler çevre yağ ve konnektif dokulardan ayrıldı. • %0,9’luk NaCl ile yıkandı, filtre kağıdıyla temizlendi. • Etkilenen testisten 3 cm uzunluğundaki seminifer tüp, WB yoluyla NF-кB’deki değişimleri tespit etmek için alındı. • Kalan testisler spermatojenik hücrelerde apopitoz değerlendirilmesi yapmak için kullanıldı.

13. Nükleer proteinlerin WB için hazırlanması: • Seminifer tüpler buzlu-soğuk fosfat tamponu (PBS) ile muamele edildi ve parçalara ayrıldı. • Hücre süspansiyonu 1200 g, 4°C de 8 dakika santrifüj edildi. • Hücre pelletleri: 100 µL lizis tamponu ile tekrar süspansiyon haline getirildi.

14. Lizis tamponu: • 10 mmol/L 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), • pH7.9, 60 mmol/L KCl, • 1 mmol/L ethylenediaminetetracetic acid(EDTA), • 1 mmol/L dithiothreitol (DTT), • 1 mmol/L phenylmethylsulfonylfluoride(PMSF), • 0.5% Nonidet P-40

15. Oluşan süspansiyondan 10 µL alındı ve eşit miktarda tripan mavisi ile karıştırıldı. • Bu karışım bütünlüğü korunmuş nükleusu tespit etmek için ışık mikroskobunda(×40) incelendi. • Geriye kalan süspansiyon tekrar santrifüj edildi. • Nükleer pellet Nonided P-40 içermeyen lizis tamponu ile yıkandı ve 1200g, 4°C de 5 dakika santrifüj edildi. • Pellet 100 µL nükleer resüspansiyon tamponu ile tekrar süspansiyon haline getirildi.

16. Nükleer resüspansiyon tamponu: • 25mmol/L Tris-HCl, • pH 8.0, 400 mmol/L KCl • 1 mmol/L DTT • 1 mmol/L PMSF • %20’lik gliserol

17. Süspansiyon 3 kere dondurulup eritildi. • 4000g 4°C de 12 dakika santrifüj edildi. • Nükleer proteinleri içeren süpernatant ayrıldı. • Süpernatantın bir kısmından protein miktarı tespit edildi. • 10 µg’lık sitoplazmik ekstrat sodium dodecyl sulfate (SDS) içinde çözüldü, 5 dakika kaynatıldı. • %10’luk akrilamid jel kullanılarak poliakrilamid jel elektroforezi(PAGE) uygulandı. • SDS-PAGE sonrasında jel nitroselüloz membrana aktarıldı(1saat, 4°C).

18. 5% yağsız kuru süt içeren PBS-0.1% Tween 20 (PBS-T) ile 4 °C’de gece boyunca bloklama işlemi gerçekleştirildi. • NF-кB’nin p65 subünitine karşı geliştirilen poliklonal antikor (0,2 µg/mL ) içeren PBS-T ile 1 saat muamele edildi. • Daha sonrasında membran PBS-T ile yıkandı. • 1saat horseradish peroxidase (HRP) ile konjuge edilmiş goat anti-rabbit IgG antikoru 1/1000 PBS-T ile dilüe edilerek uygulandı.

19. PBS-T ile yıkama sonrasında HRP aktivitesi kemilüminesans substrat kullanılarak otomatik görüntüleme yöntemi ile görünür hale getirildi. • Ekspresyonun göreceli miktarı, işaret üzerindeki bandın dansitesi ile orantılı olarak düşünüldü.

20. İmmünohistokimyasal boyama • İmmünohistokimyasal boyama, NF-кB protein tespiti için seminifer tüp hücrelerine indirekt immünoperoksidaz metodu kullanılarak uygulandı. • Hücreler, NF-кB’nin p65 subünitine karşı geliştirilen rabbit poliklonal antikor(PBS1/200 dilüe) ile 1saat oda ısısında inkübe edildi. • Sonrasında biotinlenmiş goat anti-rabbit IgG antikoru(1/500 dilüsyon) ile 1saat inkübe edildi. • Antikorlar avidin-biotin kompleksi ile görünür hale getirildi.

21. Kesitlerin hepsi Olympusmikroskobuyla incelendi. • NF-кB aktivasyonunu mikroskopta (×200)değerlendirirken alanlar rastgele seçildi. • Aktivasyon gösteren hücreler sarı boyanmıştı. • NF-кB pozitif nükleusların yüzdesi spermatojenik epitelde 100 hücre sayılarak tespit edildi.

22. Spermatojenik hücrelerde apopitozun analizi: • Testisler %0,9’luk NaCl solüsyonu ile yıkanıp filtre kağdıyla temizlendi. • Doku kesitleri 1gün formaldehid solüsyonunda bırakıldı,sonrasında parafine gömüldü. • 5 mirometre kalınlığındaki kesitler 1 gün 65 °C’de fikse edildi. • Endojen peroksidaz aktivitesi %0,3 H2O2 ile 30 dakika oda ısısında inaktive edildi. • Kesitler geçirgen hale getirilmek için permeabilizasyon tamponu içinde 5 dakika 4°C’de bekletildi.

23. İn situ işaretleme nonradioactive fluorescein-dideoxyuridine trifosfattan oluşan In Situ Apoptosis Detection Kit (Boehringer Mannheim Corp, Mannheim, Germany) kullanılarak yapıldı. • Doku kesitleri, terminal deoxynucleotidyl transferase ve fluorescein-dideoxyuridine triphosphate ile 37 °C’de 90 dakika muamele edildi. • DNA fragmanlarının 3'-OH uçları fluorescein ile işaretlendi. • Kesitler 3 kere PBS ile yıkandı. • Anti-fluorescein isothiocyanate horseradish peroxidase conjugate ile 30 dakika 37 °C’de inkübe edildi.

24. 3 kere PBS ile yıkandı. • %0.05 diaminobenzidine ile 15 dakika oda ısısında bekletilerek işaretleme yapıldı. • Örnekler 3 kere distile su ile yıkandıktan sonra Mayer hemotoksilen solüsyonu ile 10 dakika muamele edilerek zıt boyama uygulandı ve mikroskop altında incelendi. • Apopitoz değerlendirilmesi için mikroskopik alanlar (×200)rastgele seçildi. • Apopitotik hücreler sarı renk ile boyandı. • Apopitotik spermatojenik hücrelerin yüzdesi (Apopitotik indeks-AI), spermatojenik epitelde 100 hücre sayılarak tespit edildi.

25. İstatistiksel analiz • Student’s t-test, ANOVA and the Dunnett t-test kullanıldı.

26. SONUÇLAR

27. NF-кB protein seviyesinin incelenmesi, spermatojenik hücrelerde apopitozun mekanizmasını açıklamak için nükleer ve stoplazmik NF-кB protein seviyeleri incelendi. • C ve D gruplarında, nükleer NF-кB protein(t=1.405) ve stoplazmik NF-кB protein(t=1.294) seviyeleri arasında anlamlı fark saptanamadı(P>0.05).

28. A ve C gruplarında, nükleer NF-кB protein(t=1.615) ve stoplazmik NF-кB protein(t=1.144) seviyeleri arasında anlamlı fark saptanamadı(P>0.05). • A ve C gruplarıyla karşılaştırıldığında B grubunda nükleer proteindeki NF-кB seviyelerinde anlamlı artış (F=9.56, P<0.01) saptandı. • D grubuyla karşılaştırıldığında C grubunda stoplazmik proteindeki NF-кB seviyelerinde anlamlı fark (F=1.92, P>0.05) saptanamadı.

30. NF-кB katsayısıThiele ve arkadaşlarının metoduna göre hesaplandı. • C=NU/CY • NU: Nükleer NF-кB protein seviyesi. • CY: Stoplazmik NF-кB protein seviyesi. • NF-кB katsayısı için C ve D grupları arasında(t=0.995, P>0.05) ve A ve C grupları arasında(t=1.182, P>0.05) anlamlı fark yoktu. • Buna rağmen A ve C gruplarıyla karşılaştırıldığında B grubunda NF-кB katsayısında anlamlı artış(F=10.27, P<0.01) saptandı.

32. İmmünohistokimyasal boyama: • Apopitotik olayda NF-кB proteininin rolünü açıklamak için, proteinin ekspresyon seviyesi ve hücresel dağılımı incelendi. • Grup A, C ve D’de NF-кB proteininin hemen hemen tamamının stoplazmada olduğu görüldü. • B grubunda NF-кB protein seviyesi stoplazmik proteine göre nükleer protein olarak daha fazlaydı.

35. C ve D gruplarında nükleusu NF-кB-pozitif boyanan hücre oranları arasında anlamlı fark bulunamadı (t=0.834, P>0.05) • A ve C gruplarında nükleusu NF-кB-pozitif boyanan hücre oranları arasında anlamlı fark bulunamadı (t=1.711, P>0.05). • B grubundaki nükleusu NF-кB-pozitif boyanan hücre oranları A ve C grubuplarıyla karşılaştırıldığında anlamlı artış olduğu görüldü. • NF-кB-pozitif nukleuslu hücreler genellikle spermatogonia ya da spermatosit idi, birkaçı sertoli, leydig hücreleri ya da değişime uğramış endotel hücre idi.

36. Apopitozun incelenmesi • TUNEL tekniği kullanılarak spermatojenik hücrelerin AI’i incelendi. • C ve D grupları arasında(t=0.962, P>0.05) ve A ve C grupları arasında (t=1.699, P>0.05) AI açısından anlamlı farklılık bulunamadı. • AI’de A ve C gruplarıyla karşılaştırıldığında B grubunda anlamlı artış olduğu görüldü (F=8.41,P<0.01). • Apopitoz spermatogonia ya da spermatositlerde görülmesine karşın sertoli, leydig hücreleri ya da endotel hücrelerinde görülmedi.

40. TARTIŞMA

41. Testiküler torsiyon, testiküler mezorşiyumun yetersiz fiksasyonu, testisin hipermobilitesi sonucu gelişir. • Doku hasarının derecesi testiküler iskemi derecesiyle orantılıdır. • Deneysel testiküler torsiyon, testiküler iskemiye neden olur. • Torsiyonun düzelmesiyle doku tekrar kanlanır. • Testiküler torsiyon, iskemi reperfüzyon hasarına neden olur bu da spermatojenik hücrelerin kaybına neden olur. • Reperfüzyon sonrası spermatojenik hücrelerin kaybı spermatojenik hücre spesifik apopitoza neden olur.

42. Spermatojenik hücre spesifik apopitoz infertilite ile sonuçlanır. • Weins ve Lucchesi’ye göre reperfüzyon hasarı ROS ile oluşur. • ROS, parankim hücrelerde yada reperfüze venül duvarlarına yapışmış lökositlerde ksantin oksidaz sisteminin aktivasyonuyla oluşurlar. • Torsiyone testislerde torsiyon sonrası oluşan iskemi/ reperfüzyon, adezyon moleküllerinin ekspresyonu ve lökosit migrasyonu artmasına, spermatojenik hücrelerde hasarlanmaya neden olur.

43. ROS reperfüzyonu takiben iskemik dokudan salınır. • Dokuda lokal hasar oluşur bu olay da endotel hücre yüzey proteinlerinin yapımının artışıyla sonuçlanır. • Endotel kaynaklı proteinlerin ve lokal vazodilatasyonun artması, hasarlı dokuya nötrofillerin infiltrasyonunu ve bağlanmasını kolaylaştırır. • Nötrofiller, nekrozu kolaylaştırırlar ve çok miktarda ROS salarak nekroz ve hasarın artmasına neden olurlar.

44. Önceki çalışmalar, iskemi-reperfüzyon hasarında NF-кB’nin önemli rolünün olduğunu göstermiştir. • NF-кB, immün cevabın düzenlenmesiyle ilgili transkripsiyon faktörüdür. • İstirahat halinde NF-кB, p50 ve p65(RelA) subünitlerinden oluşan bir heterodimerdir. • Bu subünitler stoplazmada inhibitör proteinlere bağlı olarak bulunurlar. • Bu proteinler IкB olarak isimlendirilirler.

45. IкB’nin fosforile olup yıkılması sonrası NF-кB aktive olur. • ROS, IL-1, TNF-α gibi bazı ajanlar, IкB’nin fosforile olmasına neden olur. • NF-кB aktive hale geçtikten sonra nükleusa transloke olur. • NF-кB, intraselüler adezyon molekülü 1 (ICAM-1), vasküler selüler adezyon molekülü 1 (VCAM-1) ve E-selectin (ELAM-1)’i içeren birçok genin transkripsiyonunu aktive eder. • Bu mediatörler reperfüzyon hasarında oluşan inflamatuar olayda önemli rol oynarlar.

46. İskemi-reperfüzyon oluşmuş dokuda her zaman apopitoz gelişir. • Doku fonksiyonları değişir. • Yapılan bu çalışmada NF-кB’nin testis dokusunda oluşan iskemi-reperfüzyon hasarındaki öneminin incelenmesi amaçlanmıştır. • Araştırmacıların hipotezi, testiküler torsiyon boyunca serbest radikal üretiminin arttığı ve bunların da NF-кB’yi aktive ederek spermatojenik hücrelerde apopitozu arttırdığı yönündeydi.

47. Çalışma sonuçları, NF-кB’nin testis iskemi-reperfüzyon hasarında önemli rolü olduğunu ve sülfasalazinin testis torsiyonunu takiben kullanılmasının NF-кB’yi inhibe ettiğini göstermiştir. • Sülfasalazin, inflamatuar barsak hastalıklarında ve romatoid artirit tedavisinde güncel olarak kullanılmaktadır. • 50 yıldır yaygın olarak kullanılmasına rağmen etki mekanizması tam olarak bilinmemektedir.

48. Yakın zamanda, lökosit ve lenfosit fonksiyonları üzerinde immünsüpressif ve immünomodülatör etkileri olduğu gösterilmiştir. • Lenfositlerde IL-2 sentezini ve IL-1 üretimini inhibe eder. • Bazı çalışmalar salisilatların IкB fosforilasyonunu inhibe ederek inflamasyonu baskılayıcı etki gösterdiğini göstermiştir.

49. Wahl ve arkadaşları, sülfosalazinin IкB fosforilasyonunu inhibe ederek NF-кB’nin önemli bir inhibitörü olarak görev yaptığını göstermişlerdir. • IкB’nin fosforilasyonunu engellenmesiyle NF-кB’nin nükleusa translokasyonu önlenir ve adezyon molekül ekspresyonu azalır. • Ayrıca serbest radikal toplayıcısı olarak görev yaptığı gösterilmiştir.

50. C ve D grupları arasında yada A ve C grupları arasında NF-кB katsayısı yada AI arasında anlamlı farklılık bulunamadı. • A ve C ile karşılaştırıldığında B grubunda bu parametrelerde anlamlı artış olduğu görüldü. • Testiküler torsiyon oluşmadan sülfosalazin verildiğinde(D) NF-кB katsayısı yada AI’de artış görülmedi.