Význam proteolysy za fysiologických a patologických stavů

1. Význam proteolysy za fysiologických a patologických stavů Zdenka Kučerová

2. Funkce proteasklíčová role v kontrole buněčného cyklu štěpí peptidovou vazbu fyziologie ( vývoj, reprodukce, apoptosa, homeostasa) patologie ( záněty, neurologická onemocnění, rakovina) za fysiologických podmínek existuje rovnováha mezi proteasami a jejich inhibitory pro proteasy v lidské biologiibyl zaveden termín degradome

3. úloha proteas konverse makromolekulárníchsubstrátů na malé fragmenty, až na aminokyseliny metabolity jsou zdrojem energie, nebo se vrací pro další resyntesu nových bílkovin konverze inaktivních proproteinů nebo peptidů do formy s výraznou biologickou aktivitou(konverze zymogenů na aktivní peptidy nebo prohormonů na hormony)

4. Rozdíl mezi digestivní(zažívací trakt) a regulační(buňka) funkcí proteas znalosti o regulačním mechanismu proteas infekční onemocnění, maligní, genetických onemocnění,

5. regulační úlohave fysiologických procesech požadavky limitované proteolysy mají funkční důležitost Mnoho fysiologických reakcí, závisí na specifickém rozštěpení petidové vazby odštěpení signálních peptidů segmentaci translačních produktů mRNA bílkovinné prekursory peptidových hormonů aktivacinejrůznějších enzymů

6. Fysiologické požadavky-vlastní aktivita musí být regulována dva základní principy regulace Aktivace zymogenů limitovanou proteolysou konformační změna molekuly rozštěpení specifické peptidové vazby Inhibice specifickými inhibitory proteasové inhibitory ovlivňují aktivitu vazbou v aktivním místem enzymu

7. plasmatické inhibitoryproteas 1- inhibitor proteas, antichymotrypsin, antitrombin III»jsou homologní bílkovinám a jsoufyziologické plasmatický inhibitor 2- macroglobulin má universální specifitu a jedinečný mechanismus účinku  použití inhibitorů v terapii

8. Klasifikace proteinás • Endopeptidasyštěpí vnitřní vazbu mezi aminokyselinovými zbytky • serinové proteinasy (EC 3.4.21), pH optimum 7-9 trypsin,chymotrypsin, trombin, plasmin • cysteinové (thiolové )proteinasy ( EC 3.4.22),pH optimum 4-7 caspasy,kathepsiny, calpain • aspartátové proteinasy (EC 3.4.23), optimum pH pod 5 pepsin, gastricsin, renin, HIV proteinasa • metaloproteinasy (EC 3.4.24) pH optimum 7-9 kolagenasa, gelatinasa

9. Exopeptidasy • aminopeptidasy (EC 3.4.11) jednu aminokyselinu z N-konce polypeptidového řetězce • dipeptidylpeptidasy(EC 3.4.14) dipeptid z N-konce polypeptidového řetězce • carboxypeptidasy ( EC 3.4.16, 17 ) jednu aminokyselinu z C-konce polypeptidového řetězce • peptidyldipeptidasy ( EC 3.4.15 ) dipeptid z C-konce polypeptidového řetězce • dipeptidasy (EC 3.4.13) Štěpí dipeptidy na jednotlivé aminokyseliny • Rozdíly mezi jednotlivými proteinasami jsou založeny na substrátové specifitě • Obvykle jeden řetězec spojený disulfidickými můstky

10. Chemické vlastnosti některých proteinas enzym MW isoelektrický bod  chymotrypsino- gen A25.000 8.1 trypsin 24.000 10.8 plasmin 75.000 - elastasa 26.000 9.5 papain 21.000 8.7 pepsin 33.000 1.0 carboxypepti- dasa A 34.000 6.0

13. Inhibitory serinové proteinasy universálnínení znám, obvykle diisopropyl fosfofluoridat, chlormethylketony, aprotinin, cysteinové proteinasy většinou nespecificky modifikovaná cysteinová činidla nízkomolekulární thioly, mercaptany, aspartátové proteinasy epoxy a diazosloučeniny, pepstatin metaloproteinasy odstanění kovu, chelatory

14. SERINOVÉ PROTEINASY • Digestivnív trávicím traktu (trypsin, chymotrypsin), štěpí bílkovin potravy.Syntetisovány jsou jako zymogeny, k aktivaci jsou potřeba další proteinasy, které odštěpí aktivační peptid. • Regulačnípůsobí při limitované proteolyse na př. kaskády krevní koagulace, fibrinolysy, maligních onemocnění a dalších fysiologických i patofysiologických dějů .

15. Úvod do koagulace srážení krve»převedení rozpustného proteinu fibrinogenu na nerozpustnou sraženinu fibrin zásadní úloha koagulačních faktorů - serinové proteinasy celkem 12 koagulačních faktorů - převážně serinové proteinasy v neaktivní formě K aktivaci dochází při poškození krevního endotelu (t.zv. vnitřní system), nebo poškozením tkáně (t.zv. zevní system). Aktivované koagulační faktory vytvářejí kaskádu postupně vzájemně se aktivujících faktorů na jejímž konci je aktivace protrombinu, jehož aktivní forma trombin (k.f.II) působí přímo na fibrinogen (k.f.I).

17. Každý z enzymů kaskády má svůj specifický substrát a proteolytickou specifitu, přesto mají několik společných rysů: • Komplexy jsou funkčně analogické a mají strukturálně homologické komponenty. • Enzymové komplexy mají podobné požadavky pro shlukování a aktivitu. • V každém případě tvorba enzymového komplexu závisí na významném zvýšení a lokalizaci katalytické rychlosti aktivace substrátem.

19. Klíčové body regulace jsou spojeny s tvorbou vitamin K dependentních enzymových komplexů. • Proteolytická aktivace plasmatického prokofaktoru na aktivní kofaktor • Přítomnost vhodného povrchu membrány a možnost propojení interakcí s vazbou bílkoviny • Konverse zymogenů na serinovou proteasu

21. Lokalizace na membránovém povrchu a tvorba enzymového komplexu způsobují významný vzrůst v reakční rychlostive srovnání s proteasami v roztoku. Proteasy vázané na membráně v přítomnosti vhodného kofaktoru mají enormně zvýšenou reakční rychlost( 105 - 106 krát). Katalytická účinnost v komplexu je rovněž zvýšena. Tvorba komplexu je sama impulsem který vede k rychlému vzniku proteolytické aktivity. Disociace vede k ukončení reakce. .

22. Každý z faktorů (proteináz)je esencialní pro rovnováhu v normálním krevním srážení. • Pacienti , kterým chybí faktor VIII nebo IX mají hluboký hemostatický defekt, stejně jako ti, kteří nemají faktor X nebo V. • Pacienti s nedostatkem faktoru VII mají značně zvýšenou krvácivost.

24. Trombin je klíčový pro celou řadu důležitých dějů • transformaci rozpustného fibrinogenu na fibrin, • v agregaci destiček, • aktivaci faktoru XIII, který stabilizuje krevní sraženinu koagulum. Trombin odstraňuje N-konce fibrinopeptidy  fibrin monomerfibrinového koagula • Produkce trombinu je rychlá, autokatalytické povahy◆ zpětná vazba další koagulační komponenty ( faktor V,VIII a VII).

25. Ukončení krevní koagulace koagulem iniciované, nebo enzymy regulované • inhibice- plasmatické bílkovinnéinhibitory, včetně fibrinu.Základní je antitrombin III, má interferenci ke všem serinovým proteinasám v koagulačním systemu. • antikoagulační funkce- plasmatické proteiny C a S.Osoby s dědičně sníženou hladinou proteinu C a S mají predisposici k trombose. Aktivovaný protein C štěpí selektivně peptidové vazby ve faktoru Va a VIIIa a tím je inaktivuje. Je-li faktor Xa vázán k faktoru Va, aktivovaný protein C je neefektivní. Protektivní účinek faktoru Xa může být potlačen proteinem S. • Po tvorbě klotu následuje fibrinolysa a obnova tkáně.

26. Fibrinolysa  plasminogen je konvertován na aktivní plasmin, ten degraduje fibrin na rozpustnné degradační produkty. v dalších biologických jevech: obnova tkání, maligni transformace, funkce makrofágů, ovulace a implantace embryí Plasminogenje jednořetězcový glykoprotein konverse štěpením Arg67-Met68, Lys76-Lys77, Lys77-Val78 Plasmin je dvouřetězcová serinová proteasa s aktivním místem His-603, Asp-646, Ser-741.

27. Lidskýplasminogen aktivátor tPA je serinová proteasa, jeden polypeptidový řetězec • MW 70 000,*527 aminokyselin. • hydrolysou vazby Arg275-Ileu276 se konvertuje ve dvou řetězcovou molekulu, spojení disulfidickým můstkem • tkáňový i urikunasový aktivátor: • v jednořetězcové ( single-chain ScuPA) • dvouřetězcové formě( two-chain TcuPA). • Dvou řetězcová má 5 až 10x vyšší aktivitu

28.  Dva rozdílné aktivátory plasminogenu(PAs) tkáňový (tPA) a urokinásový(uPA) • tPA generuje plasmin pro trombolysu, enzym je neúčinný v abseci fibrinu, ale v přítomnosti fibrinu se značně zvyšuje rychlost aktivace • uPA generuje plasmin degradující ECM • Inhibice fibrinolysy se může vyskytovat právě na úrovni PA, specifickými inhibitory aktivátoru plasminogenu (PAIs).

29. Fysiologický plasminogen aktivátor tPA a scuPA aktivují plasminogen především na povrchu fibrinu. podobnost mezi fibrinem a buněčným povrchem v aktivaciplasminogenu Plasminogen je konvertován na plasmin na buněčném povrchu a takto vázaný plasmin je chráněn před rychlou inhibicí 2-antiplasminem. Umístění plasminogenu i PA na povrchu endotelialních buněk je ohniskem pro tvorbu plasminu a může hrát důležitou roli v udržení tekutosti krve a netrombogenicitě.

30. Fysiologická důležitostfibrinolysy • tendence ke krvácení - zvýšená trombolysa, zvýšený tPA, nebo deficienceinhibitorů ( PAI, antiplasmin) • tvorba trombů -defektní syntesa nebo ztráta tPA, funkční abnormalita v aktivaci plasminogenu nebo vzrůst hladiny inhibitorů tPA nebo plasminu • Léčení trombosy - rozpouštění trombu • aktivatorem plasminogenu (streptokinasa, dvou řetězcový uPA, plasminogenstreptokinase aktivator komplex rekombinantní tPA, a uPA).

32. DISREGUKACE PROTEINÁZ vlastní podstata rakovinných onemocnění Štěpení extracelulární matrix je základem pro invasi rakoviny a pro metastasy. V procesu, ve kterém je normální tkáň nahrazována rakovinou, má základní úlohu proteolytická degradace extracelulární matrix , které seúčastní řada proteas (serinové, metalo, aj.). Jejich aktivita je regulována aktivátory a inhibitory.

33. Degradace ECM probíhá v kaskádě proteolysy aspartátová proteinása (kathepsin D) aktivuje cysteinovou (kathepsin B), který může aktivovat uPA a ten pak plasminogen. Antigen, který reaguje s antiplasminogenem sera byl ve všech adenokarcinomech, (plasmin, degraduje základní membránové antigeny). Plasminogen sám není schopen se transformovat na plasmin a navíc plasmin má velmi krátkou životnost a je velmi rychle degradován, navíc existuje velké množství inhibitorů. Rakovinné buňky podobně jako embryonické sekretují plasminogen aktivátor.

34. System PA-plasminogen je zahrnut v mnoha procesech zahrnujících buněčnou migraci a znovuvytváření tkání, jako je implantace embryí, ovulace, zánětlivá angiogenese, a invasivní nádory. Nemetestasující basalní buňky karcinomů mají zřetelně nižší proteolytickou aktivitu.Klinický obraz plasminogen aktivačního systemu v invasivních tumorech a metastasách: primární rakovina prsu, rakovina žaludku, rakovina ovarií, colorectalní tumory.

36. nejprve jsou glycoproteiny degradovány pomocí kathepsinů a plasminu a poté metaloproteinasy degradují kolagen plasmin není schopen atakovat kolagen, hlavní komponentu membrány specifický enzym kolagenasa (metaloproteináza) a zjištěna u některých experimentálních tumorů přírodně se vyskytující inhibitory jsou prevencí proti rakovině Inhibice proteasové aktivity nízkomolekulárními inhibitory je dobrá strategie pro účinnou terapii rakoviny a metastas

37. Dobře je zdokumentováno spojení mezi hyperkoagulací a rakovinou. U maligních tkání byl zjištěn oncofetalní protein (CP), kterýse v normální diferencované tkáni nenalezá. Je inhibován inhibitorem serinových proteas diisopropyl fluorofosfátem.CP se může zůčastit kogulace v nepřítomnosti faktoru VII. Byly zjištěny inhibitory proteas, které léčí experimentální nádory.Z toho plyne přítomnost určitých proteas v nádorech, ty však nebyly dosud isolovány.

38. Proteasy v ovulárním procesu je zahrnuto celkem 6 proteas: plasminogen activator (PA), plasmin, metalloproteinasy(MMPs), disintegrin,ADAM (adisintegrin and metalloproteinasa),cathepsin-L Centralní nervový system (CNS)extracelularní proteasy a jejich inhibitory za fysiologických a patologických stavů

39. Aktivace komplementu Komplement je integrální součástí adaptivního a imunitního systemu-rozpoznává a eliminuje patogeny Komplement je vysoce regulovaná kaskáda proteolytických enzymů regulovaná za použití specifických inhibitorů serinových proteas Aktivace komplementu se zúčastní serinové proteinásy a jeho aktivace vede k tvorbě zánětu, zabití a odstranění patogenních mikrooganismů z krve Všechny enzymy cirkulují jako proenzymy v krvi

40. Lidský kalikrein • hormonální regulátor funkce tkání • odštěpuje kallidin ( Lys-bradykinin) z kininogenu • iniciace fibrinolysy nezávislé na plasminu, fibrinu a plasminogen aktivátoru • má účinek na snižování krevního tlaku • nachází v pankreatu, slinných žlázách, tenkém a tlustém střevě, v ledvinách a v moči, ale také v plasmě a seru • celkem 15 kalikreinů • mohou sloužit jako biomarkery

41. CYSTEINOVÉ PROTEINASY • Lysosomalní proteasy -kathepsiny, B, L, H, C, S, F, K, O, V, W a X (invasivní metastasy, Alzheimerovachoroba, záněty, rheumatoidní arthritis and osteoarthritis, multiple sclerosa, muscularní dystrophie, pancreatitida, jaterní choroby, plicní onemocnění, lysosomalníonemocnění, diabetes a srdeční choroby); kathepsiny B a L při ovulaci a těhotenství • Regulace na úrovní transkripce, translace, a intracelularních inhibitorů-cystatinů • Kathepsin B a L byly nalezeny u rozvíjejících se tumorů a metastasu rakoviny prsu , plic, hlavy a šíje, u melanomů a kolorektálních karcinomů, mají prognostický význam

42. Calpain je cytoplasmatická cysteinová proteinasa,štěpí cytoskeletální bílkoviny. Calpain hraje klíčovou úlohu v degradaci svalových bílkovin,účastní se proliferace, diferenciace a apoptosy. Může ovlinit srukturu a funkci svalu. • 2 třídy calpainů • jedna v cytosolu (calpainy 1, 2, 5, 7, 10, 13, a 15), • druhá pouze v určitých tkáních (calpainy 3, 6, 8, 9, 11, a 12) Tkáňově specifické se vyskytují u diabetu, sklerosy, rakoviny, Duchenneovysvalové dystrophie a Alzheimerovy choroby

43. caspasy - cysteinové proteasy - apoptosa • kaskada degradativních dějů, aktivována 2 drahami: přes buněčný povrch a druhá z mitochondrií • ústřední biochemická podoba apoptosy je proteolytické štěpení limitovaného množství celulárních bílkovin • Hlavními enzymy jsou cysteinové proteinasy specificky štěpící za aspartátovými zbytky - caspasy. Požadují nejméně tetrapeptid jako substrát ve kterém je Asp v posici P1, P4 je unikátní pro jednotlivé caspasy. • Kromě caspas se účastní apoptosy ještě serinové proteinasy, calpain, granzymy • Inhibitory proteolysy, účastnící se buněčné smrti (apoptosy) mají terapeutický účinek.

44. V současné době je známo 14 různých caspas. • hlavní činností je štěpení limitovaného množství selektivních substrátů. • Porozumění regulaci caspas - manipulovat apoptosu.  • Špatná regulace apoptosy způsobuje renální selhání, vasculární onemocnění, rakovinu, neoplastické, autoimunitní a nerodegenerativní choroby.  • Na základě podrobné znalosti caspas se vyvíjejí nová účinná lečiva jednak na bazi inhibitorů , ale i caspasy samotné mohou být vhodnými léčivy.  • HIV disreguluje apoptosu.

45. Aspartátové proteinázy  Aspartátové proteinázy se vyskytují jednak v trávicím traktu (pepsin, gastricsin), kde se účastní štěpení bílkovin potravy. Jsou syntetisovány jako zymogeny a musí být aktivovány. K aktivaci dochází v kyselém prostředí žaludku. Další důležité aspartátové proteinázy působí při limitované proteolyse. V těchto případech mají regulační úlohu. Byly nalezeny v lysozymech mnoha buněk (kathepsin D a E), v ledvinách ( renin), ale i v mikrorganismech napadajících lidské tělo (HIV). .

46. Kathepsin D a E Kathepsin D aspartátová proteináza obsažená v lysosomech, mnoha tkáních a buňkách lidského organismu. Kathepsin D hraje úlohu v katabolismu bílkovin, účastní se metabolismu hormonů a antigenů. Byl nalezen u patologických procesů jako je neoplasie a neurodegenerativní změny. Kathepsin E se nalézá v žaludku. Na rozdíl od pepsinů je distribuován superficialními epithelialními buňkami, pepsiny jsou produkovány glandulárními epithelialními buňkami. Zvýšená činnost kathepsinů D a E byla pozorována u neurodegenerativních onemocnění a metastas, především u rakoviny prsu. Inhibitory těchto aspartátových proteinás mají terapeutické účinky.

47. RENIN Renin (aspartátová proteinasa)jeden z hormonů vylučovaných do krve ledvinami. Štěpí specificky vazbu Leu-Leu z N-konce lidského angiotensinogenu. Výsledkem je angiotensin I ( dekapeptid). Enzym vysoce specifický, vysoce účinný pro přirozený substrát, pro jiné substrátyje neúčinný. Prorenin je aktivován trypsinem. Důležitá sekrece, regulace a aktivace. Zásadní úloha reninu v kontrole krevního tlaku Renin participuje v normální kardiovasculární homeostase, v kompensaci srdečního selhání , cirhose a v patogenesi renovasculární hypertense u lidí. Proléčení hypertense se používají inhibitory reninu.

48. AIDS způsobuje retrovirus (HIV). Obsahuje strukturální proteiny, glykoproteiny, reversní transcriptasu, endonukleasu aproteinasy. Inhibitory těchto proteinas mohou být jedním z možných způsobu terapie HIV infekce. Sekvence Asp-Thr-Gly, nebo Asp-Ser-Gly v primární struktuře. Eukariontní aspartátové proteinasy mají molekulovou hmotnost 35 kDa , retrovirální nižší pouze 10-15 kDa. retrovirální aspartátová proteinasa je aktivní jakohomodimer optimum pH cca 5 Eukariontní a retrovirální aspartátové proteinasy vznikly ze společného prapředka.

50. Přirozené preference: Phe-Pro a Tyr-Pro,důležité jsou vedlejší aminokyseliny. Účinný inhibitor musí být heptapeptid určitých vlastností. Výzkum možných inhibitorů - použití v terapii. Inhibitor musí inhibovat replikaci viru in vivo, musí účinně penetrovat do buňky, být účinný (v subnanomolárním množství), metabolicky stabilní a specifický, výhodný relativně k ostatním antivirovým činidlům. Všechny inhibitory se vážou v aktivním místě. Velkým problémem terapie je resistence během léčby. Způsobuje ji vysoká frekvence chyb při kopírování HIV genomu. Byly už vyvinuty inhibitory, které nepodléhají resistenci. Kombinace antiretroviral therapie (ART) se dvěma inhibitory nucleoside reverse transcriptase (NRTIs) plus inhibitor (PI) významě zlepšuje prognosu pacientůs HIV.