План лекции

1. План лекции • Традиционная и современная (новая) биотехнология, биотехнология растений, биобезопасность. • История разработки методов биотехнологии растений.

2. В широком понимании термином «биотехнология» обозначают использование живых организмов для производства различных продуктов, веществ и энергии. • Исторически сложилось так, что под биотехнологией долгое время понимали использование именно микроорганизмов.

3. Когда были разработаны эффективные методы культивирования изолированных клеток и тканей растений на искусственных питательных средах, появилась возможность использовать к растениям методы селекции и технологии, применяемые к микроорганизмам.

4. Регенерация растений из каллюса

5. Регенерация растений из протопластов Arabidopsis

6. Основные направления биотехнологии растений • Клеточная селекция • Использование культуры клеток растений для производства химических соединений • Клональное размножение растений in vitro. • Получение гаплоидов и манипуляции с плоидностью для повышения эффективности селекции растений • Использование методов культуры клеток и тканей растений in vitro для преодоления межвидовых репродуктивных барьеров • Генетическая инженерия и получение трансгенных растений

7. Последние годы ХХ века характеризовались бурным развитием биотехнологий, основанных на достижениях молекулярной биологии и генетики, которые получили название «современные биотехнологии» (генетическая инженерия). • Благодаря разработке методов выделения наследственного материала (ДНК), его изучения (идентификации последовательностей, кодирующих определенные гены), создания его новых комбинаций с помощью манипуляций, осуществляемых вне клетки (технология рекомбинантных ДНК), и перенесения этих новых генетических конструкций в геном клетки были получены так называемые генетически модифицированные организмы (ГМО) (синонимы: живые измененные организмы, трансгенные организмы, организмы с новыми свойствами и др.).

8. Генетическая инженерия («современная биотехнология») – это технология получения новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства.

9. Рост посевных площадей, занятых в мире под трансгенными сортами сельскохозяйственных растений.

10. Биобезопасность (безопасность генно-инженерной деятельности) - система мероприятий, направленных на предотвращение или снижение до безопасного уровня неблагоприятных эффектов ГМО • Биобезопасность имеет два основных аспекта. Первый из них связан с разработкой и применением методов оценки и предупреждения риска возможных неблагоприятных эффектов ГМО, • второй – с системой государственного и межгосударственного регулирования безопасности генно-инженерной деятельности.

11. История разработки методов биотехнологии растений • Основоположником метода культуры изолированных клеток растений считают Готлиба Габерландта [Haberlandt, 1902].

12. Габерландт предложил концепцию культуры клеток растений in vitro, согласно которой клетки растений можно культивировать длительное время на питательной среде, содержащей раствор минеральных солей и органические добавки. • Он показал, что для культивирования клеток растений необходимо соблюдать условия асептики, так как органические компоненты питательной среды могут метаболизироваться микроорганизмами. • Габерландт выдвинул гипотезу о тотипотентности растительной клетки, в соответствии с которой из культивируемых клеток можно регенерировать отдельные органы и даже целое растение.

13. История разработки методов биотехнологии растений • Неудачные попытки Габерландта культивировать изолированные клетки растений заставили его последователей обратить внимание на более простые модели – культивирование изолированных органов. • Hannig (1904), культивируя на растворе солей и сахарозы незрелые зародыши редьки Raphanus sativus, Raphanus landra, Raphanus caudatus, хренаCochlearia donica, удалось дорастить их до зрелого состояния. • Laibach (1925, 1929) продемонстрировал большое практическое значение культуры in vitro зиготических зародышей для целей отдаленной гибридизации растений. Он вычленял и доводил до зрелости на питательной среде нежизнеспособные зародыши семян гибридов между льном многолетним Linum perenne и льном австрийским Linum austriacum, благодаря чему получил межвидовые гибриды, которые не удавалось получить обычными методами.

14. История разработки методов биотехнологии растений • W. Kotte (1922) и W. Robbins (1922) постулировали, что длительную культуру клеток растений можно получить из эксплантатов, содержащих меристематические клетки, например, кончиков корня или стебля. • Значительный вклад в совершенствование метода культуры изолированных корней внес P.White (1934, 1937). Он модифицировал состав минеральных солей, в качестве источника углеводов использовал сахарозу, а вместо дрожжевого экстракта предложил смесь трех витаминов: тиамина, пиридоксина и никотиновой кислоты. Питательная среда Уайта со временем стала одной из основных в исследованиях по культуре клеток растений, она используется до настоящего времени.

15. История разработки методов биотехнологии растений • Этапное значение для развития методов культуры клеток растений имели результаты исследований R. Gautheret (1934), P.White (1939) и P.Nobecourt (1939). • Роже Готре (R. Gautheret) получил каллюс при культивировании клеток камбия ряда древесных (клена Acer pseudoplatanus, вяза Ulmus campestre, акации Robinia pseudoacacia, ивы Salix capre). Заслуга Р. Готре состоит в том, что он первым стал использовать питательные среды, содержащие ауксины, необходимые для поддержания пролиферации каллюсных клеток. • Р.White (1939) получил аналогичные результаты на культуре опухолевых тканей гибрида Nicotiana glauca × Nicotiana langsdorffii, а Р.Nobecourt (1939) добился продолжительного роста каллюсной культуры, полученной из сегментов корнеплода моркови.

16. История разработки методов биотехнологии растений • Для того, чтобы подтвердить гипотезу Г.Габерландта о тотипотентности растительной клетки, необходимо было добиться органогенеза в культуре каллюсных клеток и регенерировать целое растение. Это стало возможным благодаря открытию другой важной группы фитогормонов – цитокининов. • Первый искусственный цитокинин - кинетин был создан в Висконсинском университете [Miller et al., 1955, 1956]

17. История разработки методов биотехнологии растений • Имея в своем распоряжении более активный по сравнению с аденином кинетин, Скуг и Миллер продолжили изучение роли ауксинов и цитокининов и их взаимодействия в процессах морфогенеза в культуре клеток табака [Skoog, Miller, 1957]. Варьируя в широких пределах концентрации кинетина и ауксина, они установили, что в случае, когда их концентрации приблизительно одинаковы, имеет место интенсивный рост каллюса, повышение концентрации ауксина относительно кинетина приводит к формированию корней, а превышение концентрации кинетина над ауксином – закладке стеблевых почек, из которых можно восстановить целое растений. В результате была сформулирована концепция гормональной регуляции морфогенеза в культуре клеток in vitro.

18. История разработки методов биотехнологии растений • В 1952 г в лаборатории F.C. Steward в Корнельском университете (США) была получена суспензионная культура клеток растений путем диссоциации в жидкой питательной среде каллюсных культур [Steward et al., 1952]. Суспензию клеток можно было культивировать длительное время, периодически пересевая ее на свежую питательную среду, благодаря сконструированному в этой лаборатории встряхивающему устройству. Bergman (1960), высевая на поверхность агаризованной питательной среды суспензию клеток табака, содержащую до 90% одиночных клеток, добился образования колоний из отдельных клеток, а Vasil, Hildebrandt (1965) регенерировали растения из таких колоний.

19. История разработки методов биотехнологии растений • Изучение поведения клеток растений в суспензионной культуре дало возможность сделать важное открытие. F.C. Steward et al. (1966) Kohlenbach (1966) обнаружили, что при определенных условиях в суспензии клеток образуются биполярные зародышеподобные структуры – эмбриоиды, из которых при дальнейшем культивировании можно регенерировать целые растения.

20. История разработки методов биотехнологии растений • Таким образом, к середине прошлого века были сформулированы принципы культуры клеток растений in vitro и разработаны методические основы получения и поддержания клеточных культур на агаризованных и жидких питательных средах, получения растений-регенерантов из культивируемых клеток. • Были значительно усовершенствованы питательные среды: питательная среда, предложенная T.Murashige, F.Skoog (1962), обеспечивала усиление роста клеточных культур в 5-7 раз по сравнению со средой Кнопа, которую применяли в начале века.

21. История разработки методов биотехнологии растений • Потенциал использования методов культуры тканей in vitro для быстрого вегетативного размножения растений впервые оценил французский ученый Жорж Морель [Morel , 1963]. • Выяснилось, что культура апикальных меристем позволяет получать свободные от вирусов растения-регенеранты даже в том случае, когда в качестве источника эксплантатов использовалось инфицированное растение, причем результат был тем лучше, чем меньше был размер эксплантата. G. Morel, C. Martin (1952, 1955) впервые получили с помощью культуры апикальных меристем свободные от вирусов растения георгинов (Dahlia) и картофеля. Позднее для повышения эффективности оздоровления стали использовать нагревание растений (термотерапия) и добавку в питательную среду противовирусных препаратов (хемотерапия).

22. История разработки методов биотехнологии растений • Большое фундаментальное и практическое значение имели результаты работ индийских ученых S.Guha, S. Maheswari (1964) по культуре in vitro генеративных органов растений. Им впервые удалось получить гаплоидные растения в культуре пыльников дурмана Datura innoxia. Это означало, что тотипотентностью обладают не только соматические клетки растений, но и микроспоры, которые при определенных условиях способны менять программу развития с гаметофитной (образование зрелого пыльцевого зерна) на спорофитную. Процесс образования гаплоидов в культуре пыльников или микроспор получил название андрогенез in vitro.

23. История разработки методов биотехнологии растений • Уже в пионерских работах Gautheret (1955), Nobecourt (1955) была отмечена цитологическая нестабильность клеток при их длительном культивировании in vitro. Среди полученных растений-регенерантов также оказалось достаточно много измененных форм, в том числе с различными нарушениями хромосомного состава [Murashige, Nakano, 1966; Бутенко и др., 1967]. Явление изменчивости клеточных линий и растений-регенерантов получило название сомаклональная вариабельность. Выяснилось, что сомаклональную вариабельность можно значительно усилить с помощью мутагенных воздействий. • Появилась возможность применения к растениям технологии клеточной селекции. P. Maliga et al. (1973, 1975) вывели посредством клеточной селекции устойчивые к стрептомицину растения табака и изучили характер наследования мутантного признака в половых поколениях.

24. История разработки методов биотехнологии растений • В 1960 г. в лаборатории Эдварда Кокинга в Ноттингемском университете (Англия) была разработана методика получения большого количества протопластов из растительных тканей путем обработки их смесью пектолитических и целлюлитических ферментов, выделенных из культуральной жидкости грибов [Cocking, 1960]. • Символично, что впервые слияния протопластов добились в лаборатории Э. Кокинга [Power et al., 1970]. Однако первые растения соматических гибридов между разными видами табака (Nicotiana glauca+N.langsdorffii) были получены в США P.S. Carlson et al. (1972).

25. История разработки методов биотехнологии растений • Значительный прогресс в этой области был достигнут благодаря разработке технологии слияния протопластов под действием электрического тока [Zimmermann, Scheurich, 1981]. Хотя следует заметить, что более ранние методы слияния протопластов с помощью специфических питательных сред (высокая рН, высокая концентрация ионов Ca2+) и добавки в среду некоторых веществ (т.н. фьюзогенов: полиэтиленгликоля, диметилсульфоксида и др.) не утратили актуальность до настоящего времени, так как они не связаны с использованием дорогостоящего электрооборудования.

26. История разработки методов биотехнологии растений • В 1972 г. началась эра генетической инженерии: появились первые публикации сотрудников лаборатории П.Берга (США) , в которых описаны результаты использования технологии рекомбинантных ДНК [Mertz, Davis, 1972, Jackson, Symons, Berg, 1972]. Она, наряду с технологией клонирования генов [Cohen et al., 1973] является ключевой в современной биотехнологии (генетической инженерии), имеющей целью конструирование новых комбинаций генетического материала и перенос их в геном живых организмов для улучшения их свойств.

27. История разработки методов биотехнологии растений • Наиболее важными событиями в развитии генетической инженерии растений были разработки, касающиеся методов переноса и встраивания в геном растительных клеток созданных in vitro генетических конструкций. Революционное значение имели, прежде всего, результаты исследования механизма агробактериальной трансформации.

28. История разработки методов биотехнологии растений • В 1974 г. бельгийские ученые van Larebeke et al. (1974), Zaenen et al. (1974) установили, что у вирулентных штаммов A. tumefaciens имеется большая плазмида, получившая название Ti-плазмида (от английского tumor inducing- вызывающая опухоль), которая отсутствует у штаммов, не способных вызывать заболевание. В 1977 г M.D.Chilton et al. (1977) получили доказательство того, что опухоль возникает в результате включения в геном растительной клетки определенного фрагмента Ti-плазмиды (Т-ДНК). Причем гены, расположенные на Т-фрагменте ДНК бактериальной плазмиды, активно экспрессируются в растительной клетке, что выражается в синтезе большого количества специфических соединений опинов.

29. История разработки методов биотехнологии растений • В 1984 году с помощью агробактериальной трансформации были получены первые трансгенные растения табака с бактериальными генами устойчивости к антибиотикам [De Block et al., 1984; Horsch et al., 1984]. А через два года были получены устойчивые к вирусу табачной мозаики (TMV) трансгенные растения табака с геном белка оболочки вируса (СP-coat protein), которые могли представлять практический интерес [Powell-Abel et. al., 1986]. • В 1987 г был предложен метод прямого переноса генов в растительные клетки, получивший название метод биологической баллистики (биолистики), или как его еще называют, бомбардировки частицами (particle bombardment), генного дробовика (gene gun technique) [Sanford et al., 1987; Klein et al., 1987].

30. История разработки методов биотехнологии растений • В 1994 году в США было выдано первое разрешение на использование в качестве продуктов питания и для производства кормов трансгенных форм сои (Round Up Ready фирмы Monsanto), толерантной к гербициду глифосату, и томатов (FLAVR SAVR фирмы Calgene) с удлиненным сроком хранения плодов. С этого момента началась эра производственного выращивания генетически модифицированных сельскохозяйственных культур. В 1996 году под ГМО было занято 1.7 млн. га. Уже в 1997 году эта площадь увеличилась более чем в 6 раз (11 млн. га). В 2012 г площадь трансгенного клина составила 170,3 млн га