第十六章唾液斑检验 saliva stain examination 第一节唾液及唾液斑的特点和检验目的

第十六章唾液斑检验 saliva stain examination 第一节唾液及唾液斑的特点和检验目的发案现场的烟蒂、手帕、瓜子皮、茶杯等，或物品、尸体上的咬痕，通常对所附着的唾液作个人识别。强奸案作ABO血型检测时，应提取唾液斑作对照。一.唾液及唾液斑的特点唾液由三大唾液腺（腮腺、颌下腺、舌下腺）和小唾液腺分泌，1000-1500ml /天。水99.4%，有机成分：粘蛋白、球蛋白、AA、尿酸、唾液淀粉酶、麦芽糖酶等酶类，以及血型物质。无机物：钠、钾、钙、氯、磷酸盐、碳酸盐、硫氰酸盐等。还有口腔粘膜脱落上皮，食物残渣等。唾液斑在白色背景下呈淡黄色,在紫外线下发淡青色荧光。

二. 检验的目的与要求 目的: 达到个人识别或亲子鉴定的目的。要求: 首先要确认是唾液斑,然后作个人识别。烟蒂、手帕、瓜子皮、茶杯等皆为人类日常用品,无须作种属试验,可直接进行个人识别。对于咬痕, 需先确认是人咬痕,然后进行个人识别。

第二节唾液斑的证明 一. 淀粉酶的检测 1. 原理：唾液中含有大量α-淀粉酶（α-amylose）能水解淀粉内部的α- 1，4糖苷键，生成糖，遇碘后不再呈兰色反应。 2. 试剂: 1） 0.01% 淀粉溶液 : 10mg 可溶性淀粉 + 100ml D.W 2) 碘溶液 : 0.3g I2 + ( 0.5g KI + D.W 100ml ) 3）1% 氯化三苯基四氮唑（triphenyl tetrazole chlorid ） 3. 方法: 1) 斑痕（同时加已知和空白对照） 0.2 cm2置于试管内，加0.01%淀粉液0.1ml，37℃、30-60min;即为检材淀粉液。 2）检材淀粉液1滴，加碘液1滴，观察颜色变化。

结果: 无蓝色为阳性，说明可能存在淀粉酶,使淀粉降解为糖；变蓝为阴性。 • 评价： • 假阳性:几乎所有植物发芽种子都可出现假阳性. 故一般检材不宜超过100mg. • 假阴性:陈旧检材酶活性降低或消失. • 灵敏度：保存 6个月的唾液斑1-15mg呈阳性 .

生成糖的证明方法 1% 氯化三苯基四氮唑 1滴加于试管，再加检材淀粉液1滴；火焰上稍加热。结果：出现明显红色沉淀为阳性。稳定性: 5年以上或100℃ 20min呈阳性。二.口腔黏膜上皮细胞的检查方法:盐水浸出离心,沉淀物涂片, H.E染色镜检. 可见孤立,核大, 界限清楚的鳞状上皮细胞, 嗜碘反应阴性, 伴食物残渣, 可确定唾液斑。三. 其他方法用人唾液腮腺素免疫家兔,制备1:64的特异性抗血清, 作环状沉淀反应, 阳性为唾液斑; 阴性排除唾液斑或唾液腮腺素被破坏。

第三节唾液斑个人识别 一.唾液斑ABO血型测定 (一).中和试验唾液含水溶性ABO血型物质与精斑相仿，采用中和法，同精斑鉴定。也可用解离法、混合凝集法等。注意事项： 1.非分泌型仅含少量血型物质，可用ELISA法检测； 2.新鲜唾液含血型分解酶，须煮沸10min 后再检测； 3.口腔疾病可能干扰结果，使O变为A或B，A变为 AB，B变为O。 4.不同个体中，A或B物质一般高于H；AB型者，B＞A＞H，避免将AB错定为B；弱分泌型A、B错定为O；

(二)酶标抗体免疫测定法检测 ABO血型 这类方法灵敏度极高,适合于非分泌型唾液检验。分泌型唾液一班应先进行稀释. 常用方法有直接斑点ELISA法,间接斑点ELISA法,斑点ELISA双抗体夹心法, 及ELISA-ABC法 *例:ELISA-ABC法avidin-biotin-complex 是具有多级放大功能的生物反应系统,灵敏度高、特异性强、稳定性好。 1.生物素biotin：蛋黄、肝、肾含量较高。是羧基转化酶作用中的一种辅酶，故又称辅酶R，或维生素H，分子量为244.31，分子式为C10H16O3N2S。功能: ①能与蛋白质和核酸分子结合,使其分子成为多价。 ②可用标记物进行标记。

2. 亲合素avidin： 又称抗生物素，或卵白蛋白,存在于禽蛋、多种鸟输卵管、蛙卵胶胨中，是一种碱性糖蛋白。功能 ①由四个亚单位组成，一个亚单位可以结合一个生物素分子，故为4价分子； ②可用标记物进行标记。 3. 相互作用：亲合素对生物素有很强的亲和力，二者的结合力是抗原抗体结合强度的百万倍，一旦结合即难以解离，且不受酸、碱、有机溶剂、及蛋白酶影响。

4. 原理 : 一抗（抗A、抗B、抗H单克隆抗体）与斑痕中的抗原结合后，生物素标记的二抗（抗鼠Ig抗体）与一抗结合，再加AB*C复合物，复合物中的亲和素与二抗上的生物素结合，经标记物过氧化物酶与底物二氨基联苯胺DAB的颜色反应判断型别。灵敏度可提高数百倍。简式： Ag - Ab1 - (Ab2 - B ) - AB*C

标记酶 亲合素生物素生物素标记的二抗唾液斑抗原

资料：唾液ABO凝集素测定： a.唾液中含有与血清相同的anti-A,anti-B凝集素， 16天内的唾液斑可检出, 效价为4-16倍；可用已知红细胞检测,推断血型； b.非分泌型个体也含抗A、抗B； c.应离心去掉唾液有形成分，标准红细胞须充分洗涤，避免假阴性； d 20例观察检出率为45%，其中：Ase 6例、 ABse 1例、 Bse 1例、Ose1例, 。

二,唾液斑的DNA分析 • 唾液中含有口腔黏膜脱落上皮细胞,提取DNA后,可以进行多态性分析. • 例:烟嘴STR的检验 • 1. 烟头1枚,取接触嘴唇处的烟头皮2～3mm ,剪碎,置于0.5mlEP管内. • 2.加于5%chelex100 180μl. • 3.56℃孵化1h后,高速震荡20sec. • 4.100℃孵化9min后,高速震荡20sec. • 5.5000pmr离心3分钟. • 扩增STR位点后电泳分型.

三. 唾液多态性蛋白(略) 唾液中含有多种遗传多态性蛋白，可应用电泳方法检测，作个人识别。 1.Pa 和Pb ( acid protein and basic protein ) 方法：酸性尿素淀粉凝胶电泳法将pa分为两型：Pa (+) and Pa (-)； Pb分为3型：1、2-1、2。 2. 中带蛋白middle band protein, Pm 方法：酸性尿素淀粉凝胶电泳法将pm分为两型：Pm(+)和Pm(-)。

3． Pr和Db(proline rich protein and double band protein) 方法：碱性PAGE法将富含脯氨酸蛋白分为三型：1、2-1、2。用酸性PAGE法将双带蛋白分为Db（+）、Db（-）两型。

4．其他多态性蛋白 中性蛋白（Pn）：方法 IEF；型别Pn (+) 、 Pn (-)。腮腺重蛋白（Ph）：方法 DSD-PAGE；型别Ph (+) 、Ph (-)。慢动蛋白（Ps）和快动蛋白(Pf)：方法 disc-PAGE; 型别 Ps(a+)pf(a+)、 Ps(a+)Pf(a-)、 Ps(a-)pf(a+) 、Ps(a-)Pf(a-) 。

四. 多态性酶( 略) 唾液黏度较高，酶含量低，电泳谱带较模糊，法医学应用少。唾液淀粉酶salivary amylase, Amy：方法: PAGE; 型别:１、２－１、２、３－１、３－２、３等６种表型。唾液酯酶esterase , Set ：方法　IEF；型别　F、 S、 FS三型。唾液过氧化物酶peroxidase ,SApX：方法　acid-PAGE；型别　１、２、３三型。其他还有６－磷酸脱氢酶、酸性磷酸酶等，略。（四）. DNA多态性分析　最好的方法是PCR-STR，例如烟嘴的检验。（五）.性别鉴定X,Y染色质检查已过时。现用PCR-STR检测牙釉蛋白基因。

第十六章唾液斑检验 saliva stain examination 第一节唾液及唾液斑的特点和检验目的