Dispositivi e attrezzature per la vitrificazione

1. Dispositivi e attrezzature per la vitrificazione Dr. Lodovico PARMEGIANI GynePro Medical Centers Bologna, Italy Disclosure Lodovico Parmegiani holds an international patent, PCT/IB2009/007801 “Device and method for sterilizing liquid nitrogen by ultraviolet radiation”

2. Vitrificazione di cellule e tessuto riproduttivo umano • ovociti ed embrioni • impiego clinico in costante crescita • spermatozoi e tessuto ovarico testicolare • sperimentale/ impiego meno diffuso • Parmegiani et al, Journal of Reproductive and Stem Cell Biotechnology 2012 • tecnica • volume minimo di terreno di vitrificazione • elevata viscosità • alta concentrazione dei crioprotettori • alta velocità per “cooling” and “warming” • dominanza del warming • dispositivi specificamente progettati: carriers • immersione diretta in azoto liquido

3. Open carriers • Open Pulled Straw Vajta et al,1998 • Cryoloop Lane et al, 1999 • Hemi-Straw Vandervoost et al, 2001 • Cryotop Kuwayama et al, 2005 • Cryoleaf Chian et al, 2009 • Cryolock Bernal et al, 2009 • Vitri-inga Almodin et al, 2010 • Plastic-blade Sugiyama et al, 2010 • Rapid-I, Ultravit, etc… • gli “open carriers” sono solitamente usati per il congelamento di ovociti umani • Antinori et al, 2007; Cobo et al, 2007; Rienzi et al, 2009; Ubaldi et al, 2010; Garcia et al, 2011

4. Closed carriers • Il modello “straw-in-straw”, isola il carrier interno che contiene le cellule dal LN2 attraverso una straw esterna saldabile • Kuleshova and Shaw, 2000; Isachenko et al, 2005 • permette buoni risultati con zigoti, embrioni, blastocisti e tessuto ovarico • Liebermann, 2010; Isachenko et al, 2005, 2010 • questo sistema saldato non è preferito per gli ovociti perchè determina una riduzione nella velocità di cooling/warming • in alternativa, sono stati sviluppati “single-straw closed systems” che permettono un cooling più rapido : • CryoTipKuwayama et al, 2005 • CryopetteKeskintepe et al, 2009

5. VITRIFICATION: Direct plunging in contaminated LN2 THAWING: Immersion of contaminated carrier in warming solution at 37°C Oocyte/embryo Open Pulled Straw Cryoloop Hemi-Straw Cryotop Cryoleaf Cryolock Vitri-inga Plastic-blade M microorganism M M M M M M M M M M M M M M M LN2 (-196°C) Culture medium (37°C) Adhesion of frozen microorganisms to oocyte/embryo and on carrier’s surface Activation of warmed microorganisms and contamination of culture medium Parmegiani RBM Online 2011

6. VITRIFICATION: Direct plunging in contaminated LN2 THAWING: Immersion of clean inner carrier in warming solution at 37°C Oocyte/embryo “Straw in Straw” High Security Vitrification M microorganism M M M M M M M M M M M M M M M LN2 (-196°C) Culture medium (37°C) Adhesion of frozen microorganisms to sealed external straw No contamination of culture medium Parmegiani RBM Online 2011

7. VITRIFICATION: Direct plunging in contaminated LN2 THAWING: Immersion of contaminated carrier in warming solution at 37°C Oocyte/embryo CryoTip Cryopette M microorganism M M M M M M M M M M M M M M M Culture medium (37°C) LN2 (-196°C) Activation of warmed microorganisms and contamination of culture medium Adhesion of frozen microorganisms to carrier’s surface Parmegiani RBM Online 2011

8. “Open vitrification” • il rischio di contaminazione del terreno di coltura al “warming” - a causa del precedente contatto tra le cellule e/o la superficie esterna del carrier - non può essere escluso, se il LN2 usato per la vitrificazione/stoccaggio è stato accidentalmente contaminato • Bielanski et al, Cryobiology 2000, 2003 -Theriogenology 2011 • non tutti i closed-carriers sono sicuri • single straw closed carriers • Parmegiani et al, Fertil Steril 2012 • vitrificazione mediante “supercooled air” • Parmegiani, Fertil Steril 2011 • ultravitrificazione • Parmegiani and Vajta, Fertil Steril 2011

9. Sterilizzazione UV di LN2 • irradiazione con la dose UV necessaria per deattivare i microorganismi che sopravvivono in LN2 • Parmegiani PCT/IB2009/007801 • irradiazione UV erogata in entro un periodo breve prima che l’azoto evapori completamente • Time = UV dose/UV intensity (I)

10. Controllo dell’efficacia della sterilizzazione di LN2 assenza di contaminazione nel dewar che conteneva LN2 irradiato con UV contaminazione dei dewars prima del riempimento con LN2 A: total bacteria B: pseudomonas aeruginosa C: escherichia coli D: aspergillus niger contaminazione nel dewar dopo aggiunta ed evaporazione di LN2 Parmegiani et al, Fertil Steril 2010

11. Efficiency of LN2 - UV sterilization • la giusta dose di radiazione UV deattiva la crescita di ogni microrganismo • virus tipo Epatite: 8000 UV dose • fungi tipo Aspergillus niger: 330000 UV dose • Parmegiani et al, Hum Reprod 2009 • la decontaminazione di piccoli volumi di LN2 via UV è facile e rapida • Nterilizer, strumento per la sterilizzazione UV- LN2 assicura e certifica una dose UV minima di 660000 μWs/cm2 per ogni cliclo di sterilizzazione • Parmegiani et al, RBM Online 2010

12. Stoccaggio • lo stoccaggio dei tessuti riproduttivi è sicuro • nessuna cross-contaminazione in 25 anni • Pomeroy et al, Fertil Steril 2010; Bielanski et al, Theriogenology 2011 • ..ma qualsiasi tecnica volta a prevenire il rischio ipotetico di contaminazione deve essere benvenuta • nuove probabili leggi • diffusione della vitrificazione • è urgente stabilire un sistema di vitrificazione che impedisca qualsiasi rischio di ipotetica contaminazione delle cellule riproduttive • questo sistema in futuro potrebbe essere utile anche per altre cellule umane, tessuti, organi interi…

13. European Community regulations • Italian IVF Law (40/2004) • specimens from patients HIV/HBV/HCV positive must be cryostored in separate cryobanks • European Community directives 2006/17/EC-2006/86/EC-2004/23/EC indicate: • procedures to avoid the risk of contamination • sterile tools and devices for tissue/cells handling • procedures to sterilize tools and devices • suggested certified medical devices • allo stato attuale non ci sono linee guida o regolamenti che impediscano il contatto diretto tra tessuti e/o cellule e LN2

14. “Aseptic open vitrification”Parmegiani et al, RBM Online 2011 usando LN2 sterilizzato con UV, la vitrificazionepuòessereeseguita in manieraasetticamediante “open carriers” chevengonoracchiusi in astucciermetici primo studio al mondosull’efficacia e sicurezzadellasterilizzazione UV del LN2combinata con lo stoccaggioermeticodegliovocitiumani comparazionedella performance diovociti MII fratellifreschi e vitrificati in pazientiinfertili ovociti MII randomizzati per ICSI; gliovocitifratellisoprannumerarivitrificati dopol’insuccesso con ovocitifreschi: ICSI degliovocitivitrificati Clinical Trials Registration number: ISRCTN51912603

15. Materiali e metodi Cryotop Kuwayama et al, 2005 sterilizzazione LN2 mediante Nterilizer Parmegiani et al, 2009, 2010, 2011 Cryotops racchiusi in goblets di alluminio (pre-raffreddati) per isolarli ermeticamente allo stoccaggio precedentemente immersi verticalmente in LN2 Cryotops inseriti nei goblets tenendo la strip con gli ovociti nei vapori N2 sopra LN2 goblets chiusi ermeticamente con tappi sterilizzati e nastro adesivo

16. Risultati La sterilizzazione UV di LN2 accoppiata con stoccaggio ermetico non influenza negativamente la competenza di sviluppo degli ovociti vitrificati

17. “Efficiency of aseptic open vitrificationand hermetical cryostorage of human oocytes” • qualsiasi tipo di carrier per la vitrificazione può essere usato • si elimina qualsiasi rischio di contaminazione • si implementa la sicurezza del cryo-banking • si incoraggiano i produttori a progettare, realizzare e commercializzare contenitori ermetici per lo stoccaggio dei carriers

18. Hermetical goblets for cryostorage of human vitrifiedspecimens – Parmegiani et Rienzi, Hum Reprod 2011

19. Applicazioni future decontaminazione di dewars e criobanche “aseptic open vitrification” tessuto ovarico cellule staminali organi interi ovaio, testicolo, etc.? procedura di decontaminazione prima del warming

20. Procedura di decontaminazione al warming • microrganismi sopravvivono in LN2/NV • Parmegiani et al, Fertil Steril 2010; Grout and Morris, Theriogenology 2009 • patogeni rinvenuti in criobanche di cellule/tessuti riproduttivi umani • stoccaggio in LN2//NV • Morris, Cryobiology 2005; Bielanski,Theriogenology 2012 • l’esposizione a LN2/NV è potenzialmente pericolosa • stoccaggio non ermetico • procedure di vitrificazione aperta • contaminazione delle cellule riproduttive umane e terreno di coltura durante lo scongelamento/warming • Parmegiani et al, RBM Online 2011; Hum Reprod 2011

21. 3 wash procedureParmegiani et al, Fertility and Sterility, In Press • procedura di lavaggio prima dello scongelamento • minimizza il rischio ipotetico di contaminazione della coltura • 2 lotti di LN2 contaminati sperimentalmente • Batteri: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Stenotrophomonas maltophilia • Funghi: Aspergillus niger • inoculazione di 109 CFU • 10.000 volte più alta di quella mai rinvenuta in criobanche per uso umano • 232 carriers per la vitrificazione immersi in LN2 contaminato • Cryotop, Cryoleaf, Cryopette • 117 in LN2 con batteri • 25 in LN2 con funghi  • carriers testati microbiologicamente • randomizzati mediante software • senza alcun lavaggio (controllo) • dopo tre lavaggi successivi con azoto sterile certificato

22. 3-Wash with Sterile Liquid Nitrogen (SLN2) NTERILIZER Device for sterilization and certification of LN2 Parmegiani et al, Hum Reprod 2009 Fertil steril 2010; RBM Online 2011 WARMING CRYO BANK SLN2 SLN2 SLN2

23. 3-Wash with SLN2 - risultati e conclusioni • efficiente decontaminazione in condizioni sperimentali estreme • scongelamento di cellule riproduttive umane in crio-contenitori "non-ermetici“ • carriers per la vitrificazione, straws non ermetiche, etc • certificazione della sterilità del lotto di SLN2 • traccia dell’avvenuta decontaminazione • Controllo Qualità o per le legislazioni restrittive

24. Dispositivi e attrezzature per la vitrificazione Lodovico Parmegiani • la vitrificazione sta emergendo come il metodo di criopreservazione più impiegato per le cellule riproduttive umane • l’ottimizzazione di alcuni aspetti tecnici, come la sterilizzazione di LN2, permette di migliorare l’efficacia e la sicurezza della vitrificazione