Diagnostico Virológico HIV, HCV, HBV en Diálisis.

1. Diagnostico Virológico HIV, HCV, HBV en Diálisis. Interpretación de test Diagnósticos de Screening Dra. Noemí del Pino | Diagnobio Laboratorio | Congreso Argentino de Nefrología 2005 Pto. Iguazú - Misiones

2. Población a estudiar : DIALISIS • Los pacientes con insuficiencia renal crónico presentan alteraciones en la respuesta inmune tanto especifica como inespecífica. • La hemodiálisis aumenta la exposición del paciente a: • Materiales biocompatibles (membranas) • Endotoxinas • Sustancias en el líquidos de diálisis (inductoras de citoquinas) • Los reactantes de fase aguda están aumentados en pacientes de HD, considerados crónicamente inflamados. • Recientemente se publicó un genotipo de la IL10 asociada a la baja producción de citoquinas por los monocitos, se correlaciona con la ausencia de respuesta a la vacuna de la Hepatitis B en HD. (Inmunology 2003).

3. Los pacientes de HD son considerados población de riesgo, por lo que se recomienda testeo periódico para: HCV HBV HIV

4. Toma de muestras para test de Screening • Pueden ser procesados en Suero o Plasma. • Interferencias propias de las muestras: • Eritrocitos en suspensión. • Fibrina. • Muestras lipémicas. • Contaminación bacteriana. • Congelado y descongelado de muestras. • Muestra inactivadas.

5. Recomendaciones del CDC sobre los Test de Screening • No hay “standard” ni consensos para reportar los resultados en Test de Screening. (en distintas poblaciones) • Existen variaciones sustanciales en los informes entre laboratorios: • Seleccionar pruebas especificas y sensibles. • Tomar en cuenta las limitaciones del procedimiento. • Considerar los criterios de aceptación de cada Kit. • Interpretación de resultados. • Confirmar por métodos confirmatorios, en caso de resultados repetidamente positivos con valores de corte bajos. MMWR 2003 RECOMENDATION AND REPORT

6. Característica de los Test de Screening

7. Elección de Test de Screening • Sensibilidad. • Especificidad. • Valor Predictivo: Expresa la probabilidad que un resultado muestre el verdadero status del paciente, pudiendo ser positivo o negativo,. • Para test con alta sensibilidad y especificidad el valor predictivo depende de la prevalencia en la población a estudiar • WHO recomienda tres criterios para la elección de los test • I (objetivo para el uso del test) • II (sensibilidad y especificidad) • III (prevalencia en la población a estudiar)

8. Interpretación de CUTOFF / Valor de Corte / S/CO Significado S/CO: El valor de la densidad óptica de las muestras dividido la densidad óptica del CUT OFF establecido para el Test.

9. Interpretación de S/CO según: • Consenso Argentino Hepatitis C (2004) Método Modelo de Informe: Resultado informar S/CO => 2 (Pobla. Gral.) Dependiendo de la población en estudio y contexto clínico del paciente • CDC Evaluación de S/CO MMWR 2003;52(No. RR-3):1-15.

10. HCV

11. Marcadores virales en Hepatitis C • Indirectos: • antiHCV IgG • antiHCV IgM • Directos: • HCV RNA • HCcAg

12. Historia Natural de la infección de HCV Chronic liver disease/ cirrhosis Acute hepatitis 20-30% Symptoms/signs ALT level anti-HCV antibody RNA (RT-PCR) Normal Decades Weeks Months Years

13. Relevancia clínica de Ac anti HCV • No distingue infección aguda de crónica. • El Ac HCV core IgM no es marcador de HCV aguda.( este marcador esta presente en el 50-90% de HCV crónicos) • Los test de Screening en suero no reconocen todas las cuasiespecies de HCV No se ha identificado aún “Ac neutralizante anti-HCV”.

14. HCV Ag EIA 3.0 EIA 1.0 HCV RNA EIA 2.0 0 13 14 80 70 150 (days) Detección de marcadores del HCV

15. Enzimoinmunoensayos para la detección de anti HCV Genoma HCV C-100-3 1º Gen core NS3 NS4 2º Gen core NS3 NS4 NS5 3º Gen 4º Gen Distintos sistemas de expresión CDC

16. Test de Screening (anti HCV) relación de cut off en distintas poblaciones MMWR 2003

17. Relación S/CO EIA test versus confirmación por RIBA _ (N=18) (N=21) (N=231) (N=765) EIA S/CO Ratio 13 Source: MMWR 2003;52(No. RR-3):1-15.

18. Group prevalence 2% 10% 25% RIBA positive NAT positive Comparación S/CO EIA test versus RIBA y NAT En distintos grupos de prevalencia _ * EIA 2.0 or EIA 3.0 Source: MMWR 2003;52(No. RR-3):1-15.

19. Relación Anti-HCV CIA* S/CO Screening Test Positivos versus RIBA Prevalence > * VITROS Anti-HCV assay Source: MMWR 2003;52(No. RR-3):1-15

20. Conclusión: • De los pacientes estudiados el 12.9 % anti HCV negativos resultaron HCV – RNA positivos. • El HCV – RNA precede al anti HCV. • La condición del estado inmunológico de los pacientes Dialisys & Transplantation 1996

21. HCV Falsos positivos • Pacientes inmunocomprometidos • Todo resultados anti HCV por test de Screening con bajo S/CO deben ser corroborados con un segundo test de screening y confirmados por NAT HCV Falsos negativos • Periodos de ventana. • Pacientes inmunocomprometidos. CDC

22. HCV: Algoritmo Laboratorio según S/CO Positive* high s/co ratio† Negative (non-reactive) REPORT REPORT Screening Test for Anti-HCV Positive low s/co ratio§ RIBA™ for Anti-HCV Can be performed on same sample collected for serology NAT for HCV RNA Can only be performed if sample collected and handled in manner suitable for NAT OR Negative Positive Negative Indeterminate Positive REPORT REPORT REPORT * Repeatedly reactive by EIA or reactive by CIA †Defined as >3.8 for EIA 2.0 or 3.0 § Defined as <3.8 for EIA 2.0 or 3.0 CDC

23. HBV

24. Marcadores de virus de la Hepatitis B • IgM anti-HBc: Marcador de replicación viral. • HBsAg: Marcador de infección. • Anti-HBs: Marcador de inmunidad. • HBcAg: No presente en suero. • Anti-HBc: Marcador de infección pasada o actual. • IgG anti-HBc: Memoria inmunológica. • HBeAg:. Marcador de alto grado de infectividad. • Anti-HBe: presente en estadios agudos y crónicos.

25. Curso clínico del virus Hepatitis B • Hepatitis B Aguda: • Ac HBc Ag IgM (marcador de replicación) • HBsAg (marcador de inefectividad) • HBV-DNA (marcador de replicación directo) • HBeAg (marcador de replicación solo en pacientes infectados con cepas salvajes del HBV) • Hepatitis B Crónica: • HBsAg. • Ac anti HBC Total (IgG – IgM) • Ac anti HBs

26. Interpretación de presencia de anticuerpo anti-HBc positivo como único marcador de Hepatitis B • Sensibilidad insuficiente en los test de diagnostico para detectar Ac anti HBs. • Hepatitis B en el pasado. • Niveles no detectables de HBs Ag o portadores inactivos. • Falso positivo anti-HBc

28. Infección oculta del virus de la Hepatitis B en pacientes hemodialisados (Minuk, G et al Hepatology 2004) • 241 pacientes HD estudiados: Ac HBc Positivo • 2 (0.8%) HBsAg (+) • 239 HBsAg (-) • 9 HBV-DNA (+) (3.8%) Baja Carga Viral • 7 Mutaciones (sG145R) Conclusión: La prevalencia en este estudio de HBV oculto fue (3.8%) asociada a baja carga viral y alta prevalencia de mutantes (sG145R)

29. HBV Oculto en Donantes de Sangre 15511 Donantes (1995 – 1996) 434 Ac anti HBc (+) Recitados 167 Concurrieron a Consulta. Ac anti HCV (+) 3 (2%) Ac anti HBs (+) 142 (85%) Ac anti HBc (+) – Ac anti HBs (-) 25 6 (-) 8 Rta. a la vacuna 14/25 Falsos Positivos Fundación Favaloro

30. Virus de la hepatitis B oculto en pacientes portadores de hepatitis C en hemodiálisis • Conclusión: Viremia oculta por virus B aparece frecuentemente en pacientes anticore + con anti HbsAg +, que tienen además viremia positiva para hepatitis C, si bien es probable que no sean infectantes. Esto refuerza el concepto que deben priorisarse normas de bioseguridad sobre aislamiento de los pacientes con hepatitis C en las salas de diálisis.

31. Congreso Argentino de Nefrología 1996 107 pacientes HD 23 DNA- HBV (-) 23 HBC (+) 19 pacientes DPCA Ac anti HBs neg. 6 Investigación HBV-DNA en pacientes de HD anti HBc Positivos

32. Marcadores Serológicos Inusuales Anti - HBC AcHBC HBSAg anti HBS - + +/- + - - Marcadores Específicos HBeAg anti HBe anti HBcIgM - + + + + - Mutación Core/precore? Falso positivo HBC (mutacion HBSAg?) HBV antigeno Mutación precore/core con reactivacion? Fuente: CDC

33. Utilidad Clínica de los marcadores del HBV • Ac anti HBcore en bancos de sangre se usa como marcador subrogante ante de la infección por HIV y HBV, ya que puede estar presente durante el periodo de ventana de la infección aguda HBV luego de la desaparición de HBsAg pero antes de la aparición de Ac protectores anti HBs. • Se ha demostrado que una proporción de anti HBcore positivos son virémicos De allí la utilidad de esta prueba en banco de sangre y población de riesgo.

34. Utilidad Clínica de los marcadores del HBV (2) • Estudios sobre pacientes en HD los cuales muestran compromiso del sistema inmune debido a uremia crónica, la relación entre ALT y actividad de HBsAg en HD es imperfecta. • La respuesta inmune celular juega un papel crucial por lo que el aumento de ALT es intermitente, la carga viral del HBV fluctúa. Neophron 1995

35. Limitaciones de los Test para HBsAg • Pueden arrojar resultados FALSOS NEGATIVOS en: • Métodos comerciales de baja sensibilidad. • HBsAg con niveles por debajo del limite de detección (portadores inactivos). • Según publicaciones recientes los pacientes con Ac anti HBc como único marcador puede ser considerado portador con baja viremia. • Variantes del virus no reconocidos por los Test empleados en el diagnostico .

37. HIV

38. Test de Screening para HIV • Falsos Positivos: • Tanto en técnicas EIA como WB el rango descripto de falsos positivos (0.0004% a 0.0007%) (N. Engl I.Med 1988). • Autoanticuerpos (enfermedades autoinmunes) • Inmunosupresión • Pacientes expuestos recientemente al virus Eptein Barr. • Pacientes tratados con heparina, se pueden coagular parcialmente y producir resultados erróneos debido a la presencia de fibrina. • Tomar muestras antes de la terapia con heparina o en tubos con anticoagulante. • Muestra hemolisados y/o lipémicas. Resultados Falsos Negativos: • Periodo de Ventana (11 a 22 días): • 0.3 % en población de alta prevalencia. • < 0.005 % en población de baja prevalencia. • Respuesta atípica del huesped por causas desconocidas (AIDS 1995, MMWR 1996). • Agammaglobulina. • Subtipos O en HIV2 (JANAT 1994) (MMWR1996)

39. Detección de marcadores del HIV P24 Ag HIV RNA EIA 3.0 0 11 22 (days) 16

41. Resumen y Conclusiones • Seleccionar test de alta sensibilidad y especificidad. • Tomar en cuenta las interferencias propias de las muestras y el estado inmune del paciente. • Informar los resultados con, método utilizado, valor S/CO e interpretación del mismo (positivos – negativos). • Evaluar los test de screening y sus valores de corte en distintas poblaciones. (de alto riesgo – bajo riesgo). • Seria de suma utilidad un “consenso sobre diagnostico virológico en diálisis” a fin de estandarizar los informes de laboratorio y establecer las limitaciones de los test de screening comercializados en nuestro país.