RNA silencing:

1. RNA silencing: Small RNAs as Ubiquitous Regulators of Gene Expression

2. Skematisk opdeling af små RNAer • Box 1. A guide to 21–25nt RNAs. • Short interfering (si)RNA • Double stranded with 3 overhangs of two nucleotides • Perfectly complementary to target RNA • Directs endonucleolytic cleavage • Precursor: • Perfect or nearly perfect RNA duplex • Chromosomal or cytoplasmic • 25 base pairs in length • Micro (mi)RNA • Single stranded • Partially complementary to target RNA • Unknown mechanism of action • Often conserved between species or even across phyla • Precursor: • Bulged, partially double-stranded RNA • Chromosomal (IGR) • 70 nucleotides in length

3. Skematisk opdeling af små RNAer fortsat • Short temporal (st)RNA • Single stranded • Partially complementary to target RNA • Inhibits translation initiation • Highly conserved between species and across phyla • Precursor: • Bulged, partially double-stranded RNA • Chromosomal (IGR) • 70 nucleotides in length

4. Biologiske effekter af små ikke-kodende RNAers silencing aktivitet: • Beskyttelse af genomet mod mobile DNA elementer • Antiviralt forsvar; mange hvilke producerer dsRNAer i replikationsprocessen • Regulering af eget genom • Formation af konstitutivt heterokromatin fx set i centromer- og telomer-regioner

5. Short temporal RNAs (stRNA) i C.elegans • Eksempler: lin-4 og let-7 • De koder ikke for proteiner og udtrykkes i specifikke larvestadier • Deres sekvenser complementerer 3’ UTRs af flere target mRNAer involveret i ”developmental-timing pathways” kendte for effekt på translationseffektivitet og transkriptstabilitet • Ekspression af lin-4 og let-7 sammenfalder med repression af disse mRNAer • og Repressionen menes at igangsættes af base-parring mellem stRNA dens target-mRNA

6. stRNAer i C. elegans fortsat • Effekt af loss-off-function mutationer: ændret celledeling og ”cell-fate determinering” • 22 nt lange • Dannet udfra ca. 70 nt lange, delvist ds, bulede hårnåle-strukturerede precursor RNAer • DCR-1aktivitets-knockout resulterer i samme fænotyper som lin-4 og let-7-mutanter. RNAi er sandsynligvis krævet for modning af stRNA-precursoren • lin-4 og let-7 loci er placeret ”intergenic regions” (IGR) og har ingen ORFs (dette gælder alle små RNAers loci)

7. stRNAer i C. elegans fortsat • Eksempler på target er regioner med retrotransposon LTRs, hvor flere nærliggende meiotiske gener represseres. • LTRs har derfor muligvis en regulerende effekt på gen-ekspression ved cellulær differentiering • Typisk karaktertræk i de represserede områder er hypermethylering og hypoacethylering af DNA i specifikke mønstre • Ødelæggelse af mønsteret sammenfalder med mobilisering af transposons. Bekræfter transposons represserende rolle.

8. RNAi (interference)-systemet • RISC: RNA-induced silencing complex, afgørende rolle i modning af små ikke-kodende RNAer • Tre vigtige og evolutionært konserverede gener er (navnene er fra S. pombe): • ago1, som er en del af RISC (Argonaute) • Dcr1, en RNAaseIII helicase (Dicer) • Rdp1, RNA-directed RNA polymerase (RdRP) • Analoger af disse gener er fundet i bl.a. Arabidopsis, ris, C. elegans og Drosophila

9. stRNA pathway i C. elegans

10. Micro RNAs (miRNA) i dyr • miRNAer danner ikke perfekte Watson-Crick-hybrider med deres target mRNAer • miRNA er kodet af egne gener og regulerer gener forskellige fra disse • Mange targets er faktorer, der kontrollerer processer involveret i developmentale og fysiologiske processer og er ofte transkriptionsfaktorer • RNAi og Dicer-analoger er krævet for modning af miRNA fra ca. 70 nt precursor med hårnåle-struktur

11. miRNAer i dyr (fortsat) • Precursor dannes fra et længere transcript kaldet pri-miRNA.Dette sker i nucleus. • Pre-miRNA fungerer så som substrat for nuclear transport, og i cytoplasma dannes mi-RNA fra pre-miRNA • Nogle miRNA-gener ligger tæt sammen, hvilket foreslår, de er transkriberede som et polycistronisk transkript, der potentielt tillader deres koordinerede regulering og effekt • Størstedel af locierne er placeret i IGR eller introns og udtrykkes som uafhængige transkripter

12. miRNAer i dyr (fortsat) • targets findes som ved stRNAer bla. i regioner med retrotransposon LTRs hvor flere nærliggende meiotiske gener represseres og i UTR-motiver som har effekt på translationseffektivitet og transkriptstabilitet. • LTRs har derfor muligvis en regulerende effekt på gen-ekspression ved cellulær differentiering • Typisk karaktertræk i de represserede områder er hypermethylering og hypoacethylering af DNA i specifikke mønstre (TGS)

13. miRNAer i dyr (fortsat) • Ødelæggelse af mønsteret sammenfalder med mobilisering af transposons. Bekræfter transposons represserende rolle. • Pga. effekten af LTR synes det muligt at effekten af miRNA og RNAi ikke kun er target mRNA-degradering (PTGS) men også også TGS via fx DNA- eller histon-modifikationer som det ses ved siRNAer

15. Short interfering RNAs (siRNA) i S. pombe • siRNAer medierer silencing i trans af de samme (eller meget lig) gener, som de oprinder fra. Dvs. de laver perfekt (eller næsten) baseparring med target • Dannes udfra > 25 nt precursor-mRNA. I hårnålestruktur eller som ds RNA dannet fra transkription af både sense og antisense-streng • RISC og en histon methyltransferase (CLR4) er krævet for dannelse af i hvert tilfælde nogle af siRNAer • De er dobbeltstrengede indtil de bliver delt i RISC

16. SiRNA i S.pombe fortsat • Generne (og derfor også targets) er fundet i områder med repetitivt satellit-DNA og transposable elementer med LTRs i fx telomerer, centromerer og Mating type-region; regioner med konstitutivt heterokromatin

17. siRNAer i S.pombe fortsat • Typisk karaktertræk i de represserede områder er hypermethylering og hypoacethylering af histoner i specifikke mønstre (histone code). Ødelæggelse af mønsteret sammenfalder med mobilisering af transposons. Bekræfter transposons represserende rolle.

18. SiRNA i S.pombe fortsat • Fra generne dannes overlappende transkripter • siRNA kan kun dirigere og initiere silencing ikke sprede denne. Til dette kræves andre faktorer bla. Swi6, Clr3-6 og igen Clr4 • Der er fundet lignende sammenhænge mellem gen-silencing-mekanismer, retrotransposon-silencing og centromerisk satellit-repeat heterokromatin i pattedyr. Om RNAi er involveret vides ikke

19. siRNA pathway i S.pombe

21. Endogene små RNAer i planter der ligner dyrs siRNAer mest • Mange og diverse former i forhold til små RNAer i dyr • En lille RNA kan have flere targets = Potentiel regulering af flere gener samtidigt via simpelt system • Langt størstedelen af de små RNA-gener er fundet i IGR og transkriberes uafhængigt • De små RNA udviser vævsspecifik akkumulering, hvilket tyder på kompositionen af disse er unik i forskellige celle- og vævstyper

22. Endogene små RNAer i planter der ligner dyrs siRNAer mest • Fra generne sker en overlappende transkiption (små RNA-sekvenser overlapper). Dette ses kun hos siRNA hos dyr • De små RNAer forkommer i både sense- og antisense-orientering (også kun hos siRNA hos dyr). Andre små RNAer forkommer kun i sense-orientering • Der er perfekt baseparing mellem RNA og target og har derfor effekt på eget eller meget nært beslægtede gener (også kun hos siRNA hos dyr)

23. Endogene små RNAer i planter der ligner dyrs siRNAer mest • Plante-RNAers precursors er mere heterogene end dyrs men har også hårnåle-strukturer • Targets er både i nontransposon proteinkodende gener og • Proteinkodende gener fra LTR, non-LTR retrotransposons og transposons

24. Små RNAer i planter med fællestræk til dyre-miRNAer • Gener fundet i IGR og protein-kodende gener • De udtrykkes i forskellige udviklingsstadier • Dicer-analog (CAF) fundet værende nødvendig for miRNAs effekt. Tilhørende familie af fire proteiner, som alle har a.a. domæner karakteristiske for Drosophila-DICER.

25. Små RNAer i planter med fællestræk til dyre-miRNAer • CAF er impliceret i stamcelle-skæbne • Analogien antyder en lignende mekanisme i planter • Targets er UTR, splice sites, regioner af kodende mRNAer og promoter-regioner

26. Små RNAers regulering af gen-ekspression hos planter

27. Yderligere kompleksitet:små RNAer i forskellige str.klasser • To str.klasser af siRNAer fundet i Arabidopsis. • Lange (24-26 nt). Behøves for systemisk (celle-celle) silencing i Nicotiana benthamiana og methylering af retroelement i Arabidopsis • Lange siRNAer er unødvendige for mRNA-degradering

28. Yderligere kompleksitet:små RNAer i forskellige str.klasser • Korte (21-22 nt) siRNAer behøves for mRNA- degradering • Korte siRNA er unødvendige for effekterne set for de lange siRNAer • Forskellige str. foreslår forskellige Dicer-analoger med fx specifikke subcellulære lokaliseringer. Forskellige str. siRNA deltager i forskellige grene af RNA-silencing pathway

29. Yderligere kompleksitet: epigenetisk kontrol • Lange siRNAer involveret i retrotransposon-methylering kan blive produceret af en nuclear Dicer-homolog

30. Konklusion • Som Peter sagde… Amerikanernes definition af ikke-kodende RNA som værende noget ”junk” har intet på sig!