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BASI MOLECOLARI DELL’AZIONE DEL FARMACO BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE 3

CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi. BASI MOLECOLARI DELL’AZIONE DEL FARMACO BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE 3. Riassunto lezione n° 2 Metodi della genomatica – il Progetto Genoma Umano e sue immediate conseguenze nel mondo della biologia.

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BASI MOLECOLARI DELL’AZIONE DEL FARMACO BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE 3

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  1. CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi BASI MOLECOLARI DELL’AZIONE DEL FARMACO BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE 3

  2. Riassunto lezione n° 2 Metodi della genomatica – il Progetto Genoma Umano e sue immediate conseguenze nel mondo della biologia.

  3. GENOMATICA FUNZIONALE Studio di funzione genica

  4. I farmaci attualmente sul mercato agiscono su circa 500 prodotti genici Considerando che il genoma umano contiene circa 30.000 geni che codificano per proteine, il potenziale per lo sviluppo di nuovi farmaci è evidente

  5. LA RICERCA DELLA FUNZIONE DEI GENI • La tradizione: • ricerca di di mutazioni per identificare perdite o acquisizione di funzioni • I metodi della genetica all’incontrario: • Generare nuovi organismi geneticamente modificati per studiare perdita o acquisizione di funzioni • Metodologie innovative: • Studio comparativo di popolazioni di prodotti genici

  6. La tradizione: • ricerca e analisidimutazioni e polimorfismi (es RFLP; SNP) del genomastesso

  7. Siti polimorfici • 99.99 % della sequenza del DNA di due • individui e’ identica • la maggioranza delle differenze (0.01%) • coinvolgono singole sostituzioni • Polimorfismi al taglio con enzimi di restrizione (RFLP) • Single nucleotide polymorphysm (SNP)

  8. Polimorfismi al taglio con enzimi di restrizione (RFLP) * Allele 1 Allele 2

  9. Polimorfismi al taglio con enzimi di restrizione (RFLP) associazione RLFP-patologia Famiglia Patol. variab nella popol. sani

  10. Probability of birth sequence with a given linkage value LOD = log Probability of birth sequence with no linkage The Lod (log of odds) score (typically called logit by mathematicians) is used to calculate the probability of a pedigree arising randomly or by genetic linkage. The test was developed by Newton and Morton In practice, linkage is declared if the LOD score is equal to or greater than 3 (i.e. the likelihood of observing the result if the two loci are not linked is less than 1 in 1000). On the other hand, linkage can be completely excluded if the LOD score is strictly below -2.

  11. CROSSING OVER TRA CROMOSOMI Thomas Hunt Morgan's illustration of crossing over (1916)

  12. Studio di funzione genica Localizzazione posizionale di geni/malattia Studio di linkage familiare con polimorfismi

  13. Chromosomalwalking

  14. Huntington, la malattia ideale per position cloning Inheritance pattern – dominant autosomalEntirely penetrant and fatal Frequency - about 1/10,000 live births Late onset - age 35 to 45 Because of late onset, many have children before symptoms appear Families with a history of Huntington's disease : Indiana University maintains a National Research Roster for Huntington's Patients Large family with a history of Huntington's disease discovered living on shore of lake Maracaibo in Venezuela For both families with a history of Huntington's disease: Blood samples taken from each member Permanent cell lines established Each family member analyzed by a neurologist for disease symptoms Paternity verified

  15. 1981 - Gusella's group started with a group of anonymous probes that uncovered RFLPs - very few available. the 12th probe they tried -called G8 - indicated linkage.Disease associated with the A haplotype in the American family and the C haplotype in the Venezuelan family. LOD Scores1983 - G8 (also called D4S10) mapped approximately 4 cM from the HD locus. It took 10 more years to clone the gene. 1986-87 DNA markers were used and D4S10 was localized by in situ hybridization and somatic cell genetics to chromosome region 4p16.3; Further linkage studies for isolating HDIdentification of Putative Coding SequencesExon Trapping; Use trapped exons to identify candidate genes from cDNAs; Four transcripts were analyzed; IT15 - Huntingtin

  16. Gusella JF, Wexler NS, Conneally PM, Naylor SL, Anderson MSA, Tanzi RE, Walkins PC, et al (1983) A polymorphic DNA marker genetically linked to Huntington's disease. Nature 306:234-238 Huntingtin DNA, protein and uses thereof US Patent Issued on November 11, 1997 Inventor(s): Marcy E. MacDonald; Christine M. Ambrose; Mabel P. Duyao; James F. Gusella Assignee: The General Hospital CorporationApplication: No. 246982 filed on 1994-05-20

  17. LE PRIME AZIENDE BIOTECNOLOGICHE

  18. Sequana Therapeutics History: Sequana Therapeutics (expertise: finding new genes eg. obesity and melanoma) was acquired by Arris Pharamceuticals for $ 166 million, forming Axys Pharmaceuticals. Axys went on to form Axys Advanced Technologies, which got bought by ChemRx, becoming ChemRx Advanced Technologies. The remains of Axys were bought by Celera and now operates as Celera South San Francisco. Celera is now part of Applera

  19. Myriad Genetics Salt Lake City – 657 impiegati vendite 2005: $84,2 milioni Myriad Genetics is working on figuring out which ones you will get. Its tests can determine a patient's risk for breast or ovarian cancer (BRACAnalysis), skin cancer (MELARIS), and colon cancer (COLARIS). The company is also developing treatments for some of those myriad diseases. With such partners as Abbott Laboratories and E.I. du Pont de Nemours, Myriad is developing drugs for cancer, AIDS, and other diseases. Its lead drug candidate Flurizan is in Phase III clinical trials as a treatment for Alzheimer's disease. Other drugs being developed include brain tumor candidate MPC-6827 and blood cancer candidate MPC-2130.

  20. Metodologie innovative: • Studio comparativo di popolazioni di prodotti genici • genomatica comparativa • studio di SNP • generazione di arrays per lo studio comparato di espressione genica

  21. Studio di funzione genica Genomatica comparativa: analisi basata sulla omologia con proteine a funzione nota

  22. Ortologo e paralogo • Ortologhi – geni omologi con la stessa • funzione in organismi diversi • Paraloghi – geni all’interno dello stesso • organismo derivanti da duplicazione genica

  23. Geni ortologhi o paraloghi

  24. Fino a qui lezione terza

  25. ARRAY MACROARRAY MICROARRAY

  26. DNA microarray (o gene/genome chip, DNA chip, o gene array) è una collezione di depositi puntiformi di DNA, ciascun punto rapresentante un singolo gene immobilizzati su un supporto (vetro, plastica o silicone) mediante legami di tipo irreversibile. Esempio di microarray con 40.000 oligo immobilizzati su supporto solido e ibridati con cDNA

  27. APPLICAZIONI DI ARRAY: • SNP detection arrays - Looking for Single nucleotide polymorphism in the genome of populations • comparative genomic hybridization (Array CGH) - Assessing large genomic rearrangements. • mRNA or gene expression profiling - Monitoring expression levels for thousands of genes simultaneously is relevant to many areas of biology and medicine, such as studying treatments, disease, and developmental stages. For example, microarrays can be used to identify disease genes by comparing gene expression in diseased and normal cells (reference?). • Chromatin immunoprecipitation (chIP) studies - Determining protein binding site occupancy throughout the genome, employing ChIP-on-chip technology

  28. Siti polimorfici per singola sostituzione di base (SNP) Perchèunavariazionepossaessereconsiderata un SNP deveesserepresente in almeno l’1% dellapopolazione Gli SNP sono la causadi circa il 90% dellavariabilitàgeneticaumanaed in generesitrovauno SNP ogni 100-300 pb. 2/3 SNP vedonosostituita la C con T. Individuo 1 Individuo 2

  29. Siti polimorfici per singola sostituzione di base (SNP) • di base http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/snps.html Nel genoma umano ci sono 200.000 SNP all’interno di sequenze codificanti Metodi di identificazione di SNP

  30. IBRIDAZIONE ALLELE-SPECIFICA

  31. REAZIONE DI ELONGAZIONE DI PRIMER FISSATO SU SUPPORTO SOLIDO

  32. Studio di funzione genica Studio di trascrittoma (trasncriptomics) Studio di proteoma (proteomics) Studio di metaboloma (metabolomics) Studio di interattoma

  33. Drugs x Cells Genes x Cells ClusteredImageMaps Genes x Drugs

  34. DatabaseMicroarray Experiment SetsSample Profilesas of Date • Genomics and bioinformaticsgroup • NCI and NIH

  35. Chip-on-chipanalysis per lo studio delle interazioni DNA proteine

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