1 / 86

第六章 重组 DNA 技术的操作过程

第六章 重组 DNA 技术的操作过程. A DNA 的体外重组（切、接） B 用于基因转移的受体菌或细胞 C 重组 DNA 分子的转化和扩增（转、增） D 转化子的筛选和鉴定（检）. 第六章 重组 DNA 技术的操作过程. 切. 接. 转. 增. 检. 第六章 重组 DNA 技术的操作过程. 同种内切酶生产的粘性末端的连接. 同尾酶生产的粘性末端的连接. 不同粘性末端的连接. 一 DNA 的体外重组（切与接）. 人工粘性末端的连接. 粘性末端的更换. 重组率.

niles
Download Presentation

第六章 重组 DNA 技术的操作过程

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 第六章 重组DNA技术的操作过程 A DNA的体外重组（切、接） B 用于基因转移的受体菌或细胞 C 重组DNA分子的转化和扩增（转、增） D 转化子的筛选和鉴定（检）

  2. 第六章 重组DNA技术的操作过程 切 接 转 增 检

  3. 第六章 重组DNA技术的操作过程 同种内切酶生产的粘性末端的连接 同尾酶生产的粘性末端的连接 不同粘性末端的连接 一 DNA的体外重组（切与接） 人工粘性末端的连接 粘性末端的更换 重组率

  4. 外源DNA片段同载体分子连接的方法，即DNA分子体外重组技术，主要是依赖于核酸内切限制酶和DNA连接酶的作用。外源DNA片段同载体分子连接的方法，即DNA分子体外重组技术，主要是依赖于核酸内切限制酶和DNA连接酶的作用。 • 一般说来在选择外源DNA同载体分子连接反应程序时，需要考虑到下列三个因素： (1) 实验步骤要尽可能地简单易行， (2) 连接形成的“接点”序列，应能被一定的核酸内切限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段， (3) 对转录和转译过程中密码结构的阅读不发生干扰。

  5. A同种内切酶生产的粘性末端的连接 GAATTC GAATTC CTTAAG CTTAAG AATTC G 5' 5' G CTTAA AATTC AATTC 5' 5' G G 5' 5' 5' AATTC 5' G G G G CTTAA CTTAA5' CTTAA 5' GAATTC GAATTC GAATTC GAATTC CTTAAG CTTAAG CTTAAG CTTAAG 5' 5' EcoRI 退火 AATTC G G CTTAA AATTC G G CTTAA T4-DNA ligase 5' 5' 5' 5'

  6. B同尾酶生产的粘性末端的连接 GGATCC GGATCC 5' 5' CCTAGG CCTAGG 5' 5' 5' 5' TGATCA T T T ACTAG ACTAG ACTAGT ACTAG5' TGATCC TGATCC GGATCA GGATCA ACTAGG ACTAGG CCTAGT CCTAGT BclI BamHI 5' 5' GATCA GATCC G 5' G T CCTAG 5' 5' 退火 GATCC G GATCA G CCTAG T 5' GATCC G GATCA G CCTAG T 5' T4-DNA ligase 5' 5' 5' 5'

  7. C不同粘性末端的连接 GGATCC GGATCC 5' 5' CCTAGG CCTAGG 5' 5' CTGCA CTGCAG C G G GACGTC CGATCC CGATCC GGATCG GGATCG GCTAGG GCTAGG CCTAGC CCTAGC PstI BamHI 5' G 3' GATCC G 5' G 3' ACGTC CCTAG 5' 5' T4-DNA pol 切平 Klenow 补平 G 5' GATCC GGATC 5' C CTAGG CCTAG 5' 5' T4-DNA ligase 5' 5' 5' 5'

  8. G CTTAA 5' GAATTGGGGGGGATCC GAATTGGGGGGGATCC CTTAACCCCCCCTAGG CTTAACCCCCCCTAGG D人工粘性末端的连接 5‘突出末端 EcoR I BamH I 5' 5'AATTC GATCC G 5' G G CCTAG 5' 5' Klenow 补平 Klenow 补平 GAATT 5' 5'AATTC GATCC GGATC 5' CTTAA 5' TTAAG CTAGG CCTAG 5' 5' TdT dGTP TdT dCTP GAATTGGGGGG AATTC GATCC GGATCCCCCCC CTTAA GGGGGGTTAAG CCCCCCCTAGG CCTAG 退火 T4-DNA ligase BamH I BamH I 5' GGATCCCCCCCAATTC CCTAGGGGGGGTTAAG 5' 5' GGATCCCCCCCAATTC CCTAGGGGGGGTTAAG 5'

  9. GCATGCCCCCCTGCAG GCATGCCCCCCTGCAG GCATGCCCCCCG GCATGCCCCCCG CGTACGGGGGGACGTC CGTACGGGGGGACGTC C GGGGGGACGTC C GGGGGGACGTC D人工粘性末端的连接 3‘突出末端 Sph I 5' GCATG 3' C G CTGCA 3' Pst I C 3' GTACG 3'ACGTC G 5' TdT dCTP TdT dGTP GCATGCCCCCC 3' C G CTGCAGGGGGG3' C 3'CCCCCCGTACG 3'GGGGGGACGTC G 退火 5' CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG 5' 5' CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG 5' Klenow T4-DNA ligase Pst I Pst I 5' CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG 5' 5' CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG 5'

  10. T T T T GTTTTTTTTTTG GTTTTTTTTTTG T T A A A A T T A A GT TG A A CAAAAAAAAAAC CAAAAAAAAAAC CA AC TG CA CA AC A A GT TG A A T T AC GT AAAA T T TTTT D人工粘性末端的连接 平头末端 5' G 3' C G C 3' C 3' G 3' C G 5' TdT dTTP TdT dATP GTTTTTTTTTT 3' C G CAAAAAAAAAA3' C 3'TTTTTTTTTTG 3'AAAAAAAAAAC G 退火 T4-DNA ligase 5' CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG 5' 5' CAAAAAAAAAAC GTTTTTTTTTTG 5' 加热 S1

  11. E粘性末端的更换 GGATCC CCTAGG 5' 5' BamHI 5' G GATCC 5' CCTAG 5' G 5' Klenow 补平 5' 5' GGATC GATCC CCTAG 5' CTAGG 5' T4-DNA ligase GGAATTCC EcoR I linker CCTTAAGG EcoR I 5' GGATCGGAATTCCGATCC CCTAGCCTTAAGGCTAGG 5'

  12. F重组率 重组率的定义 重组率 = 含有外源DNA的重组分子数 / 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75% 重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以 大大简化DNA重组的后续操作。

  13. F重组率 GAATTC GAATTC CTTAAG CTTAAG G CTTAA OH5' 提高重组率的方法 提高外源DNA片段与载体的分子比：5 : 1 - 10 : 1 载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团： 5' 5' 碱性磷酸单酯酶 碱性磷酸单酯酶 EcoRI 5' 5'HO AATTC 5'p AATTC G G G CTTAA p 5' 5' 退火 HO OH G A-A-T-T-C 5' G-A-A-T-T-C C-T-T-A-A-G C-T-T-A-A G 5' HO OH

  14. F重组率 GCATGCCCCCCG GCATGCCCCCCTGCAG C GGGGGGACGTC CGTACGGGGGGACGTC 提高重组率的方法 加装同聚尾末端： 5' GCATG 3' C G CTGCA 3' C 3' GTACG 3'ACGTC G 5' TdT dCTP TdT dGTP GCATGCCCCCC 3' C G CTGCAGGGGGG3' C 3'CCCCCCGTACG 3'GGGGGGACGTC G 退火 5' CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG 5' Klenow T4-DNA ligase 5' CTGCAGGGGGGCATGC GACGTCCCCCCGTACG 5'

  15. 受体细胞应具备的条件 二 用于基因转移的受体菌或细胞 各种基因工程受体的特性 实验室常用的基因工程受体

  16. A 受体细胞应具备的条件 一、宿主的选择 • 从安全性考试，应具备以下条件： 1. 不适合在人体内生存 2. 不适合在非培养条件下生存 3. 在非培养条件下，其DNA容易解体 4. 它的DNA不易转移 5. 它的质粒只在这一宿主由复制 6. 便于检测

  17. A 受体细胞应具备的条件 从遗传性考虑： 1.重组缺陷型recA－，用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-） 2.限制系统的缺陷，或是修饰系统的缺陷。避免对外源DNA的除解。外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-） 3.与重组质粒的遗传性状要有显的差异（具有与载体选择标记互补的表型） 4. 具有较高的转化效率

  18. B 各种基因工程受体的特性 大肠杆菌 遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定 产物结构复杂、种类繁多的内毒素 适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌

  19. B 各种基因工程受体的特性 枯草杆菌 遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全 ，生长迅速，培养简单，不产内毒素 遗传欠稳定，载体受体系统欠完备 适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌

  20. B 各种基因工程受体的特性 链霉菌 抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素 遗传不稳定，生长相对缓慢 主要用于抗生素生产菌株的改良

  21. B 各种基因工程受体的特性 酵母菌 具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定 内源性蛋白产物种类繁多且含量高 适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌

  22. B 各种基因工程受体的特性 昆虫细胞（家蚕） 具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定 DNA重组操作系统欠完善 适用于真核生物基因的高效表达

  23. B 各种基因工程受体的特性 哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞 CHO） 与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统 细胞培养条件苛刻，生长缓慢 适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体

  24. B 各种基因工程受体的特性 植物细胞（拟南芥菜、烟叶） 农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用 遗传操作繁琐 适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良

  25. C 实验室常用的基因工程受体 大肠杆菌 用于接受质粒：C600、W3110、HB101、JM83、 JM101（Aps、Tcs、Cms）用于接受l-DNA：LE392、ED8654 酵母菌 毕赤酵母 啤酒酵母 哺乳动物细胞 CHO

  26. 转化的原理与技术 转化率 三 重组DNA分子的转化和扩增（转与增） 转化细胞的扩增

  27. A 转化的原理与技术 Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化 Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态

  28. A转化的原理与技术 Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化 大肠杆菌感受态细胞的制备： 100 ml 菌体培养至OD600 = 0.5，离心收集菌体 用10 ml 冰冷的10 mMCaCl2溶液悬浮菌体，离心 收集菌体 用1 ml 冰冷的75 mMCaCl2溶液悬浮菌体 冰浴放置12 - 24小时，备用

  29. A转化的原理与技术 Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化 大肠杆菌感受态细胞的质粒转化： 取100 ml 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组 DNA连接液，混匀 冰浴放置半小时 在42℃保温 2 分钟（热脉冲） 快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 2分钟 加入1 ml 新鲜培养基，于37℃培养 1 小时（扩增） 涂在合适的固体培养基平板上进行筛选

  30. A转化的原理与技术 细菌原生质体的转化 革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子 酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化

  31. A转化的原理与技术 细菌原生质体的转化 细菌原生质体的制备： 不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂

  32. A转化的原理与技术 细菌原生质体的转化 细菌原生质体的转化： 取0.2 - 1ml的原生质体悬浮液（108-109个原生质体），加入10 - 20 ml DNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀 细菌原生质体的再生： 原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素

  33. A转化的原理与技术 l噬菌体DNA的转染 感受态细胞的培养： 将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基 中培养至OD600 = 0.5 吸附： 加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30℃保温10分钟 转染裂解： 加入20倍体积的新鲜培养基，30℃培养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选

  34. A转化的原理与技术 电穿孔转化 将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大 同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验

  35. B 转化率 转化率的定义 转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）

  36. B 转化率 转化率的定义 例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共有3.4X1011个分子（6.02X1017 / 2686X660），也就是说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞 另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNA

  37. B 转化率 转化率的用途 利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模 例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/mg载体， 经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得104个 重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？ 若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要： 104 / 107X 10 - 2 = 0.1 mg 载体DNA 考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为： 0.1 / 20% = 0.5mg 载体DNA 载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按10∶1的要求算 出（5 mg），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选

  38. B 转化率 转化率的影响因素 载体及DNA重组分子方面： 载体本身的性质： 不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同 载体的空间构象： 质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载 体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的 超螺旋质粒低两个数量级 插入片段的大小： 对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低

  39. B 转化率 转化率的影响因素 受体细胞方面： 受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高

  40. B 转化率 转化率的影响因素 转化方法方面： 受体细胞的预处理：影响最大 供受体的比例： Ca2+诱导转化 0.1 ml 感受态细胞 50 ng DNA 原生质体转化 109个原生质体 50 ng DNA 转化方法： Ca2+诱导转化 106 - 107 / mg DNA 原生质体转化 105 - 106 / mg DNA l-DNA转染 107 - 108 / mg DNA 电穿孔转化 106 - 109 / mg DNA

  41. C 转化细胞的扩增 扩增操作 转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如： Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时 原生质体转化后的再生过程 l噬菌体转染后的30℃培养等，均属扩增操作

  42. C 转化细胞的扩增 扩增操作的目的 增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序 扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选 表达外源基因，便于筛选和鉴定

  43. 载体遗传标记检测 四 转化子的筛选和鉴定（检） 克隆DNA序列检测 外源基因产物检测

  44. 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子 四 转化子的筛选和鉴定（检） 转化子 重组子 目的重组子

  45. A载体遗传标记检测 抗药性筛选法 抗药性筛选法的基本原理： EcoR I Cla I 抗药性筛选法可区分转化子与非 Hind III Pst I 转化子、重组子与非重组子 BamH I Pvu I 将外源DNA片段插在EcoRI位点： Pst I r r Ap Tc Sal I 非重组子呈 Apr、Tcr pBR322 4363 bp 重组子呈 Apr、Tcr 将外源DNA片段插在BamHI位点： ROI Bal I ROP 非重组子呈 Apr、Tcr ori Hind II 重组子呈 Apr、Tcs

  46. A 载体遗传标记检测 抗药性筛选法 抗药性筛选法的基本操作： Ap 先将转化液涂布含有Ap的平板 再将Ap平板上的转化子影印至 挑选 影印 含有Ap和Tc的平板上 在Ap平板上生长、但在Ap和Tc 平板上不长的转化子即为 Ap + Tc 重组子

  47. A载体遗传标记检测 营养缺陷型筛选法 营养缺陷型筛选法的基本原理： 营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子

  48. A载体遗传标记检测 营养缺陷型筛选法 常见的营养缺陷型筛选标记： 用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+ 用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激 酶基因tk，相应的受体细胞则选择tk-缺陷型

  49. A载体遗传标记检测 营养缺陷型筛选法 • 常见的营养缺陷型筛选标记： • 胸腺嘧啶核苷激酶简称胸苷激酶（thymidine Kinase,TK）在所有真核细胞中都有表达, 是嘧啶生物合成补救代谢途径中的一个关键酶, 它可催化胸苷磷酸化转变成为dTMP, 继续磷酸化生成dTTP, 参与DNA的生物合成。 TK 胸腺嘧啶核苷激酶 TK TR dTMP dTDP dTTP

  50. A载体遗传标记检测 营养缺陷型筛选法 常见的营养缺陷型筛选标记： 含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺陷的受体细胞（tk -）不能在含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)、胸腺嘧啶核苷(T)的培养基上（HAT培养基）生长，载体上的标记基因tk能与之遗传互补. TK-细胞因氨基喋呤抑制了dTTP的合成而死亡，TK+细胞可存活，以此进行筛选. AP dCDP dTDP dTTP AP 氨基喋呤

More Related