Spettrometria di massa

4. Spettrometria di massa • Separazione di ioni in fase gassosa in funzione della loro massa molecolare • Analisi di frammenti che si generano per attivazione e selezione di un singolo ione

5. Spettrometro di massa Rivelatore Sorgente Analizzatore m/z

6. Sorgenti • Ionizzazione diretta • EI, CI • Desorbimento • FAB • MALDI • Nebulizzazione • ESI

7. Ionizzazione diretta

10. MS & Proteomics

12. Spettro ESI del Tripsinogeno (MW 23983) M + 15 H+ 1599.8 M + 16 H+ M + 14 H+ 1499.9 1714.1 Relative Abundance M + 13 H+ 1845.9 1411.9 1999.6 2181.6 m/z Mass-to-charge ratio

13. 1599.8 1499.9 1714.1 1845.9 1411.9 1999.6 2181.6 Calcolo accurato della massa (MR = 23983 Da) • (M+n+3)/(n+3) = 1499.9 • (M+n+2)/(n+2) = 1599.8 • (M+n+1)/(n+1) = 1714.1 • (M+n)/n = 1845.9 n = 13 • (M+16)/16 = 1499.9  23982.4 • (M+15)/15 = 1599.8  23982.0 • (M+14)/14 = 1714.1  23983.4 • (M+13)/13 = 1845.9  23983.7

16. Quadrupolo Uses a combination of Radio Frequency(RF) and Direct Current(DC) voltages to operate as a mass filter. • Has four parallel metal rods. • Lets one mass pass through at a time. • Can scan through all masses or sit at one fixed mass.

19. Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI)

20. Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI)

21. Schema esemplificato del processo di ionizzazione MALDI

23. time-of-flight (TOF) Ion Source Flight Tube 20-25 kV Detector Principle: If ions are accelerated with the same potential at a fixed point and a fixed initial time and are allowed to drift, the ions will separate according to their mass to charge ratios.

24. time-of-flight (TOF) Ion Source Flight Tube Detector The ions enter the flight tube with the lighter ions travelling faster than the heavier ions to the detector

25. time-of-flight (TOF) Ion Source Flight Tube Detector The lighter ions strike the detector before the heavier ions. This “time of flight” (TOF) can be converted to mass

26. MALDI/TOF MASS SPECTROMETRY

29. 40000 30000 20000 10000 0 Spetto MALDI/TOF di IgG MH+ Relative Abundance (M+2H)2+ (M+3H)3+ 50000 100000 150000 200000 m/z

30. Mass Analyzers

31. Risoluzione e sensibilità

32. Risoluzione MALDI

33. Peptide mass fingerprinting

38. Limiti del peptide mass fingerprinting • La proteina non è presente nel database • La proteina è ricca di modificazioni co/post-traduzionali • Lo spot nasconde più di una proteina

40. Mass spectrometer LC Fraction collector 0.18mm X 15cms C18 column 7:1 flow split 4µl/min La sorgente ESI può essere collegata all’uscita di un sistema di separazione 400nl/min Further MS analysis

41. MS/MS

42. m1 m2 m4 m3 m2 m1 m4 m3 mass scanning mode m1 m2 m2 m2 m2 m2 m4 m3 single mass transmission mode Quadrupolo

43. Tandem MS

44. MS/MS

45. Frammentazione dei peptidi

46. LC-MS-MS

48. Isotope-coded affinity tagging

49. ICAT

50. ICAT