1 / 52

La Citometría de Flujo en el Diagnóstico y Seguimiento de la Hemoglobinuria Paroxística Nocturna (HPN)

III Reunión Anual de la Asociación Valenciana de Hematología y Hemoterapia Castellón, 27 de febrero de 2009. La Citometría de Flujo en el Diagnóstico y Seguimiento de la Hemoglobinuria Paroxística Nocturna (HPN). Amparo Sempere Servicio de Hematología H.U. La Fe. HPN Definición.

niveditha
Download Presentation

La Citometría de Flujo en el Diagnóstico y Seguimiento de la Hemoglobinuria Paroxística Nocturna (HPN)

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. III Reunión Anual de la Asociación Valenciana de Hematología y Hemoterapia Castellón, 27 de febrero de 2009 La Citometría de Flujo en el Diagnóstico y Seguimiento de la Hemoglobinuria Paroxística Nocturna (HPN) Amparo Sempere Servicio de Hematología H.U. La Fe

  2. HPNDefinición • Enfermedad clonal adquirida de la célula hematopoyética pluripotencial • Mutación somática en el gen PIG-A (fosfatidil-inositol-glucano de clase A) implicado en la síntesis de glucosilfosfatidilinositol (GPI) • Carencia total o parcial de la expresión de proteínas ancladas a la membrana a través del componente GPI en parte de la células hematopoyéticas

  3. HPNAlteración genética: Gen PIG-A Bloqueo en la HPN • Uno de los más de 20 genes implicados en la síntesis de las proteínas ancladas a GPI • Se encuentran mutaciones del gen PIG-A en todos los casos en que se ha interrumpido la síntesis de GPI • Como consecuencia de la mutación se reduce o falta la expresión de proteínas ancladas a la superficie de la célula por moléculas de GPI PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

  4. HPNProteínas ancladas a GPI • Enzimas: acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina granulocítica • Moléculas de adhesión: CD48, CD58, CD66b-c • Proteínas reguladoras del complemento: • CD55: factor que acelera la degradación de las convertasas del complemento (DAF) • CD59: inhibidor de membrana de la lisis reactiva (MIRL) • Receptores: CD14, CD16, CD87, CD90 • Antígenos de grupos sanguíneos eritrocitarios • Antígenos del neutrófilo • Otros: CD24, CD52 Hernández-Campo et al. Med Clin. 2008; 131: 617-630

  5. Distribución de las proteínas ancladas a GPI CD55 CD58 CD59 PrPC AChE JMH Ag Dombroch HG Ag Células B CD24CD55 CD58CD59 CD48 PrPC CD73 CD108 Células progenitoras hematopoyéticas Hematíes CD55 CD58* CD59 CD48 CD52 CD87 CD108 PrPc ADP-RT CD73 CD90 CD109 CD16* Células T CD55 CD58 CD59 CD109 PrPC GP500 Gova/b Plaquetas CD59, CD90, CD109 Células NK CD55 CD58* CD59 CD14 CD16 CD24 CD48 CD66b CD66c CD87 CD109 CD157 LAPNB1 PrPC p50-80 GPI-80 ADP-RT NA1/NA2 Monocitos CD55 CD58 CD59 CD48 CD52 PrPc CD16 (Cortesía de Lucio Luzzatto) PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK PMN CD14 CD55 CD58* CD59 CD48 CD52 CD87 CD109 CD157 Grupo 8 PrPC GPI-80 CD16

  6. Déficit de proteínas GPI: hemólisis intravascular • La reducción o ausencia de CD55 y CD59 en la superficie de los eritrocitos los hace muy vulnerables a la acción del complemento y provoca su destrucción • CD55 (DAF): previene la formación de complejos C3-C5-convertasa esenciales para la amplificación de la secuencia de activación de las proteínas del sistema de complemento • CD59 (MIRL): inhibe la formación del complejo de proteínas del sistema del complemento C5b-C9 de ataque de membrana • Déficit de CD59: formación de poros en la membrana y muerte celular

  7. CD59 CD59 Complejo de ataque a la membrana HPNCascada del Complemento Vía alternativa Vía clásica CD59 PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

  8. HPNTipos de hematíes según sensibilidad al complemento • HPN tipo I: sensibilidad normal a la acción del complemento • HPN tipo II: sensibilidad intermedia (3-5 veces superior a la normal). Déficit parcial de CD59 • HPN tipo III: sensibilidad elevada (15-25 veces superior a la normal). Déficit total de CD59 Rosse WF, Dacie JV. J. Clin Invest 1966, 45: 736-748 Rosse WF, Dacie JV. J. Clin Invest 1966, 45: 749-757

  9. HPNIncidencia y prevalencia • Enfermedad rara, pero grave • Incidencia: 1,3 casos por 1.000.000 habitantes y año • Prevalencia: 7-16 casos por 1.000.000 habitantes • Afecta igual a hombres y mujeres Hill A et al. Blood 2006; 108: A985

  10. HPNHistoria Natural

  11. HPNHistoria Natural • Amplio espectro de manifestaciones clínicas • Mediana de edad al diagnóstico  40 años • Mortalidad atribuible  50% (trombosis y citopenias) • La trombosis es la principal causa de mortalidad y de morbilidad • Mediana de supervivencia: 10-25 años • Remisión espontánea: 15%

  12. HPN Clínica Anemia aplásica Trombosis Hemoglobinuria • Hemólisis intravascular– síntomas 1 • dolor abdominal • disfagia • disfunción eréctil • letargia • Trombosis2,3 • - hepática, cerebral •  50% • de pacientes • Insuficiencia medular • puede preceder a la HPN4,5 1. Rother et al. JAMA 2005;293:1653-627. 2. Hillmen P, Lewis SM, Bessler M et al. N Engl J Med 1995;333:1253-8. 3. Socie G, Mary JY, Gramont A et al. Lancet 1996;348:573-7. 4. Wang et al. Blood 2002;100:3897–902. 5. Dunn et al. Ann Int Med 1999;131:401–8.

  13. HPNClasificación • HPN clásica: hemólisis intravascular, % elevado de granulocitos deficientes en proteínas GPI y una población mayoritaria de hematíes tipo III. Sin otra enfermedad medular asociada • HPN asociada a otras hemopatías: hemólisis intravascular en el contexto de otra enfermedad medular como AA y SMD • HPN subclínica: sin evidencia clínica ni analítica de hemólisis. Mediante citometría de flujo se detectan pequeños clones de células de HPN. Asociación frecuente con insuficiencia medular (AA y SMD) Parker C et al. Blood 2005;106:3699-709

  14. ¿HPN sintomática o molecular? • Mosaicismo: células progenitoras normales y patológicas • Enfermos con pequeños clones raramente tendrán síntomas relacionados con la HPN • En pacientes con clones de granulocitos HPN < 10% la clínica de hemólisis será mínima o nula (AA y anemia refractaria) • Un clon de granulocitos HPN superior a 50%: mayor riesgo de trombosis • El tamaño del clon puede variar con el tiempo y un 15% de enfermos con HPN hemolítica pueden tener remisión espontánea • El tratamiento va a depender, en gran medida, de la presentación clínica y del tamaño del clon HPN

  15. HPNTratamiento • Sintomático (transfusiones, anticoagulación oral, corticoides, ácido fólico, hierro,…) • Trasplante de progenitores hematopoyéticos: único tratamiento curativo • Eculizumab (anti-C5): nuevo tratamiento específico de la HPN (Registro Internacional de HPN)

  16. Eculizumab: Anticuerpo anti-C5 Human framework regions CH1 Hinge CL Complementarity determining regions(murine origin) CH2 Human IgG4 heavy chain constant regions 2 and 3 Human IgG2 heavy chain constant region 1 and hinge CH3 Rother et al. Nature Biotech 2007;25:1265–73

  17. Eculizumab CD59 CD59 Complejo de ataque a la membrana HPNCascada del Complemento Vía alternativa Vía clásica CD59 PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

  18. HPN¿Quién debería ser estudiado? • Hemoglobinuria • Hemólisis intravascular no inmune (Coombs negativo, LDH elevada) especialmente si ferropenia • Trombosis de localización infrecuente: síndrome de Budd-Chiari, venas abdominales, cerebrales o dérmicas • Anemia aplásica • SMD: Anemia refractaria • Disfagia o dolor abdominal y hemólisis intravascular • Citopenias mantenidas de origen desconocido Parker C, Omine M, Richards S et al. Blood, 2005; 106: 3699-709

  19. HPNEvaluación inicial • Estimar el grado de hemólisis: hemograma, reticulocitos, LDH sérica, bilirrubina fraccionada y haptoglobina • Determinar el grado de insuficiencia medular: aspirado y biopsia de médula ósea y citogenética • Establecer el déficit de proteínas asociadas a GPI: detección de poblaciones de células de sangre periférica (hematíes, neutrófilos y monocitos) deficientes en antígenos asociados a grupos GPI Parker C, Omine M, Richards S et al. Blood, 2005; 106: 3699-709

  20. HPNMétodos Diagnósticos • Pruebas clásicas: aumento de la sensibilidad de los hematíes a la lisis mediada por el complemento • Citometría de flujo (CMF): ausencia de proteínas asociadas a grupos GPI • Análisis molecular: secuenciación e identificación de mutaciones del gen PIG-A

  21. HPNPruebas Clásicas Pruebas de Ham-Dacie y de sacarosa • Técnicas laboriosas • Difícil estandarización • Restringidas a hematíes • Falsos negativos (especialmente en pacientes transfundidos) • Requiere un 5% de células tipo III (déficit total) o un 20% de tipo II (déficit parcial) para dar resultados positivos • Interés histórico

  22. Suero fresco acidificado inactivado por calor Suero fresco acidificado + magnesio Suero fresco Suero fresco acidificado Salino + hematíes Control de sacarosa Sacarosa PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

  23. HPNAnálisis Molecular • Secuenciación del gen PIG-A • No aplicable como técnica de rutina • Laboratorios de investigación

  24. HPNCitometría de Flujo • Nicholson-Weller, 1985: aplicación de la CMF al diagnóstico de la HPN • Van der Schoot, 1990: superioridad de la CMF sobre la prueba de Ham • Hall & Rose, 1996: CMF como método de elección • Brodsky, 1999, 2000: método diagnóstico alternativo, proaerolisina conjugada con fluoresceína (FLAER, de fluorescein-labelled AERolysin) Vidriales M. B. Haematologica (ed. esp.) 2008; 93 (Supl.2); 9-11

  25. Citometría de FlujoVentajas • Rapidez (1 hora) • Sensibilidad (clones <1%) • Marcaje múltiparamétrico: con tres anticuerpos la sensibilidad puede llegar a 0,01% • Análisis de diferentes líneas celulares • Detección de clones de hematíes tipo I/II/III • Cuantificación y monitorización del tamaño del clon HPN

  26. HPNCitometría de Flujo • El análisis por citometría de flujo es el método de elección para el diagnóstico y seguimiento de la HPN

  27. Citometría de FlujoCélulas Analizar un mínimo de dos líneas celulares: • Hematíes • Neutrófilos y monocitos • Linfocitos: discrepancias en el tamaño clonal respecto a los neutrófilos • Plaquetas: expresión débil y variable de proteínas GPI en controles sanos

  28. Citometría de Flujo Tamaño del clon HPN • Tamaño del clon de hematíes - Tipos de hematíes: I/II/III - Proporción de hematíes HPN en relación a la última transfusión • Tamaño del clon de neutrófilos: refleja mejor el tamaño del clon HPN • Tamaño del clon de monocitos: valida el tamaño del clon HPN (puede tener discrepancias con los neutrófilos)

  29. Citometría de FlujoEstudio de hematíes • Análisis multiparamétrico con marcaje directo • Adquisición con SSC/FSC en escala logarítmica • Estudio de dos antígenos GPI diferentes: CD55 y CD59 (permite descartar deficiencias congénitas aisladas) • Incluir un AcMo frente a un antígeno eritroide no asociado a GPI para seleccionar los hematíes (CD235a) • CD59: discrimina hematíes tipo I, II y III • Las transfusiones afectan el tamaño del clon de hematíes (realizar estudio tras un mínimo de un mes desde la última transfusión) • El estudio puede realizarse hasta 2 semanas tras la extracción de la muestra (mantener los hematíes a 4º C) • Incubación mínima de 15 min y un solo lavado • Incluir un control de sangre normal

  30. Hematíes: análisis multiparamétrico Combinación CD59 FITC/CD55PE/CD235a PE-Cy5 Cullen M. PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

  31. CD59: Identificación y cuantificación de clones HPN PNH Count CD59 FITC-A Tipo I: células con expresión normal de CD59 Tipo II: células con deficiencia parcial de CD59 Tipo III: células con deficiencia completa de CD59 PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

  32. HPN clásica: hematíes Control Control HPN clásica Tipo III HPN clásica Tipo II Tipo I

  33. HPN CD59: hematíes <1% HPN subclínica HPN AA 12,2% Tipo II 84% Control HPN clásica Tipo I Tipo III

  34. Citometría de FlujoEstudio de leucocitos • El análisis en granulocitos es superior al de hematíes para establecer el tamaño del clon HPN • El estudio debe ser multiparamétrico lo que permite detectar de forma simultánea la deficiencia de antígenos GPI e identificar clones de HPN de pequeño tamaño • Es muy importante la selección de los AcMo contra antígenos GPI (alta expresión en células normales, específicos de una línea celular, baja afinidad por uniones inespecíficas y combinables en un marcaje múltiple) • Es recomendable utilizar AcMo no asociados a GPI para seleccionar la población diana • La técnica de FLAER permite detectar pequeños clones HPN

  35. Citometría de FlujoNeutrófilos y monocitos • Sangre periférica en EDTA (<24 horas) • Análisis multiparamétrico con marcaje directo • Neutrófilos: CD16, CD24, CD55, CD59 y CD66b • Monocitos: CD14, CD52, CD55, CD59 • Selección de la población: CD15, CD33 • Se debe valorar la presencia de formas inmaduras y displasia (citología/CMF). • Adquisición de 100.000 eventos • Incluir un control normal de forma paralela • CD55 y CD59: lisar y marcar • Análisis inicial de neutrófilos y monocitos (CD16/CD14), si compatible con HPN analizar hematíes

  36. Estrategia de análisis: neutrófilos y monocitos P1+P3 = granulocitos P2+P4 = monocitos Cullen M. PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

  37. Neutrófilos: CD16 Control HPN Subclínica HPN Clásica

  38. Neutrófilos: CD55 HPN AA 3,5% Control HPN clásica: 92%

  39. Neutrófilos: CD55 HPN subclínica: 1,2% HPN AA: 6,5% HPN clásica: 92% Control

  40. Monocitos: CD14 HPN AA: 7% Control HPN clásica: 93%

  41. Monocitos: CD55 HPN AA: 6% HPN clásica: 93% Control

  42. Citometría de FlujoFLAER • La aerolisina es una toxina secretada por la Aeromonas hydrophila, que produce hemólisis mediante la unión a la molécula GPI • La proaerosilina es una variante inactiva de la proteína bacteriana que está conjugada con fluoresceína (FLAER) y que mantiene la capacidad de unión a GPI sin causar lisis • Restringida a leucocitos, permite la identificación y cuantificación de pequeños clones de HPN (<0,02%) • Puede utilizarse sola o en combinación con más anticuerpos dirigidos frente antígenos GPI • Permite el análisis de pacientes con SMD Brodsky RA, et al. Blood 1999; 93: 1749-1756. Brodsky RA, et al. Am J Clin Pathol 2000;114:459–466

  43. FLAER Alexa 488 Citometría de Flujo FLAER Células normales Células normales Células HPN Brodsky RA, et al. Am J Clin Pathol 2000;114:459–466

  44. FLAER: análisis de los clones HPN HPN Clon de granulocitos HPN = 8,9% Clon de monocitos HPN = 8,1% FLAER/ CD24 /CD16 /CD33/CD15/CD14 Cullen M. PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK

  45. HPNCMF: Seguimiento • El seguimiento y la monitorización del clon de HPN es esencial en el manejo clínico del enfermo • En los enfermos en tratamiento con eculizumab aumenta el clon de hematíes y se iguala al de neutrófilos en unos 6 meses de media • Monitorizar el clon de granulocítos es importante por el riesgo de trombosis • En HPN subclínica se recomienda controlar el tamaño del clon tras iniciar tratamiento con inmunosupresores • El tamaño del clon puede variar con el tiempo y pacientes con un clon de HPN estable y de tamaño intermedio peden tener una remisión espontánea Richards SJ et al. Cytometry 2007; 72B: 291-298

  46. Citometría de Flujo Seguimiento del clon HPN Controles mínimos (Registro Internacional de HPN): • Pacientes con HPN clásica sin eculizumab y en HPN asociada o subclínica: anual • Enfermos con HPN con eculizumab: al inicio del tratamiento, a los 6 meses y después anual • Reevaluación si cambios clínicos Richards SJ et al. Cytometry 2007; 72B: 291-298

  47. SeguimientoClon de hematíes con eculizumab HPN clásica: 60% diagnóstico Células control HPN clásica: 95% 1 año con eculizumab

  48. SeguimientoClon de neutrófilos con eculizumab HPN clásica: 94%, diagnóstico Células control HPN clásica: 98%, 1 año con eculizumab

  49. HPN CMF: Temas pendientes • El Registro Internacional de HPN requiere que los datos aportados sean lo más homogéneos posible • El uso de diferentes técnicas complica la estandarización de los resultados • No se dispone de criterios inmunofenotípicos validados para el diagnóstico de HPN • Falta de consenso en la estrategia de análisis y en la selección de los anticuerpos • Necesidad de reuniones de consenso

  50. Citometría de FlujoReunión de Consenso • Objetivo principal: intentar llegar a un consenso en los puntos esenciales del diagnóstico de HPN por CMF, para tratar de disminuir, en lo posible, las diferencias técnicas e intentar homogeneizar los resultados entre distintos laboratorios Madrid, 27 de enero 2009

More Related