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Studies on the Dose-effect Relationship and P harmacokinetics of Weichang’an pill

Studies on the Dose-effect Relationship and P harmacokinetics of Weichang’an pill. Advisor ： Prof. Gao Wenyuan Master candidate ： Qu Zhuo Date ： 2013-06-22. 1. 2. 3. 胃肠安丸的研究进展. 胃肠运动机制. 中药对胃肠运动的调节作用. Review. Review.

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Studies on the Dose-effect Relationship and P harmacokinetics of Weichang’an pill

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  1. Studies on the Dose-effect Relationshipand PharmacokineticsofWeichang’an pill Advisor：Prof. Gao Wenyuan Master candidate：Qu Zhuo Date：2013-06-22

  2. 1 2 3 胃肠安丸的研究进展 胃肠运动机制 中药对胃肠运动的调节作用 Review

  3. Review • Weichang’an Pill , a traditional Chinese medicine (TCM) formula, has been used to treat irritable bowel syndrome and functional diarrhea for several decades.

  4. Review 1 胃肠安丸的研究进展 化学成分 药效学 作用机制 其他 对泻下的蒽醌类成分，胃肠安丸甲醇提取物，巴豆霜中的脂肪油类成分和二萜类成分均进行过分析。胃肠安丸甲醇提取物中的68个化合物，对其中的41个化合物进行了结构鉴定 • 抗腹泻作用 • 对平滑肌的作用 • 抗炎镇痛作用 • 抑菌 • 抗轮状病毒的作用 • 抗内毒素作用， • 安全性评价 • 小肠消化酶：乳酸脱氢酶（LDH）、苹果酸脱氢酶（MDH）和乳糖酶活性 • 胃肠激素：血管活性肽（VIP）、P 物质（SP） • Na+-K-+ATPase活力 • 近端结肠组织AQP4表达 气相色谱-电子捕获检测(GC-ECD)法测定5个不同批次胃肠安丸中六六六(BHC)、滴滴涕(DDT)和五氯硝基苯(PCNB)3种有机氯农药残留

  5. Review 2 腹泻作用机制 胃肠运动机制 平滑肌收缩

  6. Review Targets of anti-diarrhea Na+-K+-ATPase AQP4 Substance P（SP） target inducible nitric oxide synthase （iNOS) Na+/H+ exchange 3 (NHE3) vasoactive intestinal peptide（VIP）

  7. Review 中枢神经系统 自主神经系统 神经内分泌系统 肠神经系统 激素释放 肠平滑肌纤维 平滑肌细胞 （离子通道 ： Ca2+、K+、Na+） Ref. Sigrid Elsenbruch. 2011. Abdominal pain in Irritable Bowel Syndrome: A review of putative psychological, neural and neuro-immune mechanisms. Brain, Behavior, and Immunity 25, 386–394

  8. Ca2+ channels Ca2+ channels Acetylcholine receptors Acetylcholine receptors Dopamine receptors 5-HT receptors Review Targets of smooth muscle contraction and relaxation target

  9. Review 钙离子在平滑肌细胞收缩中的作用 细胞膜外Ca2+ 肌浆网Ca2+ 钙离子通道 多种机制 细胞浆游离Ca2+↑ 启动平滑肌收缩装置 平滑肌收缩 戴芸, 刘新光, 谢鹏雁, 等. 钙稳态失衡在致结肠平滑肌收缩性改变中的作用.中华内科杂志.2003,42(9):615-617 Kenton M. Sander. Mechanisms of calcium handling in smooth muscles. Journal of Applied Physiology. 2001,91: 1438–1449,.

  10. Review Intracellular stores of Ca2 + release Concentration of[Ca2 +]i↑ Extracellular Ca2 + influx Smooth Muscle contraction Extracellular Ca2 + influx Smooth muscle relaxation Na+/Ca2+exchange Intracellular Ca2 + release Concentration of[Ca2 +]i ↓ calcium pump The relationship between calcium homeostasis and intestinal smooth muscle contraction 戴芸, 刘新光, 谢鹏雁, 等. 钙稳态失衡在致结肠平滑肌收缩性改变中的作用.中华内科杂志.2003,42(9):615-617 Kenton M. Sander. Mechanisms of calcium handling in smooth muscles. Journal of Applied Physiology. 2001,91: 1438–1449,.

  11. Review Ca 2+ channels Ching-Chung Tsai, Shih-Che Huang, Jong-Kang Liu, Hsiu-Chuan Wang, Tong-Rong Tsai, Ping-Ju Tsai, Ching-Wen Liu, Li-Ching Chang . Salvia miltiorrhiza causes tonic contraction in rat ileum through Ca2+-calmodulin pathway. Journal of Ethnopharmacology, Volume 142, Issue 3, 1 August 2012, Pages 694-699

  12. Review Ca 2+ channels This study showing the presence of antidiarrheal, antispasmodic and bronchodilator activities in Fumaria parviflora possibly mediated through dual blockade of muscarinic receptors and Ca2+ channels Najeeb-ur-Rehman, SamraBashir, AdnanJ.Al-Rehaily, Anwarul-HassanGilani. Mechanisms underlying the antidiarrheal, antispasmodic and bronchodilator activities of Fumaria parviflora and involvementoftissueand species specificity. Journal of Ethnopharmacology 144 (2012) 128–137.

  13. Review Acetylcholine receptors （A） Active state：the ACh release is increased, therefore the smooth muscle contraction and the gastrointestinal motility is enhanced. （B）Inactive state ：the ACh release is decreased and the smooth muscle contraction is reduced. This might lead to the development of constipation. P. Mandl, J.P. Kiss. Role of presynaptic nicotinic acetylcholine receptors in the regulation of gastrointestinal motility. Brain Research Bulletin 72 (2007) 194–200

  14. Review 3 单体对胃肠运动的影响 中药对胃肠运动的影响 单味药材对胃肠运动的影响 复方对胃肠运动的影响

  15. Review 神经调节：NE↑(↓)，Ach ↑( ↑)，5-HT ↑( ↑); 体液调节：胃泌素↑( ↑) ，促胃液素↑( ↑），CCK ↑( ↑)，促胰液素↑(↓），SP ↑( ↑)，VIP ↑(↓) ，SSTR ↑(↓)，抑胃肽↑(↓).

  16. Conclusion 胃肠安丸 胃肠运动机制 中药对胃肠运动的作用 胃肠安丸体内的抗腹泻作用主要针对正常小鼠和新斯的明引起的胃肠功能亢进小鼠来评价；体外的解痉作用主要是从药物对不同的受体和Ca2+通道的作用进行，把量效与靶点结合，进行简单的机制研究，这也是我们体外研究所包含的内容。 研究内容

  17. Experiment

  18. 实验进展 . 炭末推进实验 离体肠平滑肌收缩实验 酚红实验 Ach 5-HT Ca2+通道 体外研究 胃肠安丸量效学的研究 入血成分分析 体内研究 . 采用血清药物化学手段，对典型量效的入血成分进行分析。 红色-已完成，蓝色-正在进行

  19. 实验方法 酚红实验 • 胃排空率(%) =(1-A胃内酚红/A基准酚红)×100% 观察指标 =酚红前进的距离/小肠的全长×100% • 小肠推进率(%) = A小肠某段酚红/A小肠各段酚红之和×100% • 小肠推进相对百分率(%)

  20. 换能器 台式液 （37℃） 95%O2+5%CO2 标本槽 实验方法 离体肠平滑肌收缩实验 WCA pill

  21. 实验 胃肠安丸对正常小鼠肠推进和胃排空的影响 Fig. 1. Effects of different doses of ME on gastrointestinal transit and gastric emptying in normal mice. Compared with normal mice: * P<0.05 or ** P<0.01 对正常小鼠肠推进的影响：给药剂量的增大，促进肠推进。 对正常小鼠胃排空的影响：在整个给药剂量范围内，胃排空均受到抑制；当给药剂量为0.8、1.6、3.2 g/kg时，与正常组比较，抑制作用显著。

  22. 实验 胃肠安丸对新斯的明小鼠肠推进和胃排空的影响 Fig. 2. Effects of different doses of ME on gastrointestinal transit and gastric emptying in neostigmine mice. Compared with neostigmine mice: * P<0.05 or ** P<0.01 对新斯的明小鼠肠推进的影响：小剂量0.05-0.8 g/kg的给药剂量时，促进肠推进；继续增大给药剂量，抑制肠推进。 对新斯的明小鼠胃排空的影响：在整个给药剂量范围内，胃排空均受到抑制；当给药剂量为1.6、3.2 g/kg时，与模型组比较，抑制作用显著。

  23. 实验 胃肠安丸对正常小鼠肠推进的影响 Table 1. Effects of different doses of WCA on gastrointestinal transit in normal mice. Compared with normal mice: * P<0.05 or ** P<0.01 对正常小鼠：空白对照组中酚红主要集中在第3段；给予不同剂量WCA后，酚红在小肠内的推进情况有所不同，小剂量时，酚红主要集中在第4、5段；大剂量时，与空白对照组无显著性差异。

  24. 实验 胃肠安丸对新斯的明小鼠肠推进的影响 Table 2. Effects of different doses of WCA on gastrointestinal transit in neostigmine mice. Compared with neostigmine mice: * P<0.05 or ** P<0.01 对新斯的明小鼠：模型组中的酚红在第1、2、3、4和5段都有分布；给予小剂量WCA后，与模型组比较，第1段的酚红量增加；当给药剂量增大到1.6 g/kg 时，第3段的酚红量增加，第4段酚红量减少说明此剂量对肠推进有抑制作用。

  25. 实验 不同极性部位胃肠安丸对空肠平滑肌的影响 A B Fig. 3. Effects of different polar parts extracted from WCA pill on Ach-induced contraction of rat-isolated jejunum (A) average tension (B) inhibition. 对Ach引起的离体空肠平滑肌异常收缩的影响：不同极性部位的胃肠安丸对空肠的异常收缩均有抑制作用；随着极性的增大，抑制作用减弱。

  26. 胃肠安丸甲醇提取物主要成分HPLC-MS分析 1 • 色谱条件 • 色谱柱：Kromasil（250 mm×4.6mm I.D.，粒径5 μm）；微量进样器（25 μL，Hamilton）；流动相：A：乙腈-甲醇（50：8），B：0.5%醋酸水溶液，梯度洗脱条件见表2-1；柱温：35 ℃；流速：1mL/min；检测波长：230 nm，254 nm，280 nm。 • 质谱条件 • m/z扫描范围：100～1000 u；干燥气温度：325 ℃；干燥气流速：10.0 L/min；雾化气压力：27.6 Pa；离子化方式：ESI（+）和ESI（-）；电喷雾电压：3500 V。 2 流动相梯度洗脱程序 图1 胃肠安丸HPLC-MS分析色谱图. 图2胃肠安丸对照品HPLC-MS 分析色谱图. (A) 正离子模式下总离子流色谱图 (B) 负离子模式下总离子流色谱图 (C)正离子模式下多级质谱色谱图 (D) 负离子模式下多级质谱色谱图 (E) 230nm波长条件下液相色谱图. (F) 254nm波长条件下液相色谱图. (G) 280nm波长条件下液相色谱图. 张静泽，高文远，刘振，等. 胃肠安丸化学成分分析[J].药物评价研究. 2010,33(2):116-120.

  27. 典型量效的入血成分和代谢物的分析 生物样品样品处理方法考察 为了避免血浆中的内源性杂质的干扰，实验中考察了不同血浆样品处理方法处理。血浆蛋白沉淀以甲醇、乙腈沉淀除蛋白；液液萃取；固相萃取小柱处理四种方法进行处理，比较萃取回收率及基质干扰。 固相萃取小柱处理

  28. 典型量效的入血成分和代谢物的分析 A B C (A)胃肠安丸甲醇提取物HPLC-MS色谱图；(B) 空白血样HPLC-MS色谱图；(C)胃肠安丸甲醇提取物给药后血样HPLC-MS色谱图.

  29. 实验 不同浓度胃肠安丸对空肠平滑肌自主性收缩的影响 Fig. 4. Effects of different concentration s of ME on contraction of jejunum 对离体空肠平滑肌自主性收缩的影响：在0.01-2.0 mg/mL浓度范围内呈剂量依赖性；2.0 mg/mL、4.0 mg/mL和6.0 mg/mL这三个浓度下的抑制率和张力值无显著性差异，出现平台期。

  30. 实验 不同浓度胃肠安丸对空肠平滑肌的影响（5-HT-induced） A B Fig. 5. Effects of different concentration s of ME on 5-HT-induced contraction of jejunum (A) inhibition.(B)average tension. 对5-HT引起的离体空肠平滑肌异常收缩的影响：在0.01-6.0 mg/mL浓度范围内呈剂量依赖性:随着加药浓度的增大，张力值减小，抑制率增大。

  31. 实验 不同浓度胃肠安丸对空肠平滑肌的影响（Ach-induced） B A Fig. 6. Effects of different concentration s of ME on Ach-induced contraction of jejunum (A) inhibition.(B)average tension. 对Ach引起的离体空肠平滑肌异常收缩的影响：在0.01-2.0 mg/mL浓度范围内呈剂量依赖性；当加药浓度为2.0 mg/mL时，对平滑肌的收缩作用抑制最强；2.0 mg/mL、4.0 mg/mL和6.0 mg/mL这三个浓度下的抑制率和张力值无显著性差异，出现平台期。

  32. 实验 不同浓度胃肠安丸对空肠平滑肌的影响 (KCl-induced） A Fig. 7. Effects of different concentration s of ME on KCl-induced contraction of jejunum (A) inhibition.(B)average tension. 对KCl引起的离体空肠平滑肌异常收缩的影响：在0.01-2.0 mg/mL浓度范围内呈剂量依赖性；当加药浓度为2.0 mg/mL时，对平滑肌的收缩作用抑制最强；继续增大加药剂量，抑制率降低。

  33. 实验 不同浓度胃肠安丸对空肠平滑肌的影响 （CaCl2-induced） 四个浓度的WCA使得CaCl2量效曲线右移，和阻滞剂的行为一致，推测WCA对肠道平滑肌的作用和Ca2+通道有关。 Fig. 8. Dose–effect curves of CaCl2 on rat-isolated jejunum in the absence (◆) and in the presence of the methanol extract of WCA pill ( 0.01 mg/ml▲; 0.02 mg/ml●; 1 mg/ml〤; 2 mg/ml∣) and verapamil (■).

  34. 配伍后成分药代动力学 胃肠安丸组方中药味配伍药动学 Pharmacokinetics 一、木香中木香烃内 酯及去氢木香内 酯药动学研究 胃肠安丸 Costunolide 木香 Dehydrodehydrocostus lactone

  35. 配伍后成分药代动力学 胃肠安丸组方中药味配伍药动学 • 给药后血样中木香烃内酯及去氢木香内酯测定方法的建立 Pharmacokinetics 2. 木香药材给药后血样中木香烃内酯及去氢木香内酯药物浓度的测定 胃肠安丸 Costunolide 木香 3. 胃肠安丸给药后血样中木香烃内酯及去氢木香内酯药物浓度的测定 4. 木香与大黄、巴豆霜配伍对木香烃内酯及去氢木香内酯药代动力学的影响 Dehydrodehydrocostus lactone

  36. 配伍后成分药代动力学 胃肠安丸组方中药味配伍药动学 • 给药后血样中木香烃内酯及去氢木香内酯测定方法的建立 木香 2. 木香药材给药后血样中木香烃内酯及去氢木香内酯药物浓度的测定 Sesquiterpenes i.g. 3. 胃肠安丸给药后血样中木香烃内酯及去氢木香内酯药物浓度的测定 Marker HPLC-MS analysis 4. 木香与大黄、巴豆霜配伍对木香烃内酯及去氢木香内酯药代动力学的影响 Study on Pharmacokinetics

  37. 配伍后成分药代动力学 胃肠安丸组方中药味配伍药动学 • 给药后血样中木香烃内酯及去氢木香内酯测定方法的建立。 1.1血浆样品处理方法考察 1.2方法特异性 1.3标准曲线 Costunolide Dehydrodehydrocostus lactone IS: [M+H]+ m/z: 285 1.4精密度 1.5稳定性 -H2O -H2O -CO -CO C15H20O2+H+ C15H18O2+H+ C15H21O2+ C15H19O2+ C15H19O+ C15H17O+ C14H17+ C14H19+ Costunolide m/z 233 m/z 231 m/z 213 m/z 215 m/z 187 m/z 185 Dehydrodehyrocostuslacton 1.6回收率

  38. 配伍后成分药代动力学 胃肠安丸组方中药味配伍药动学 • 给药后血样中木香烃内酯及去氢木香内酯测定方法的建立。 1.1血浆样品处理方法考察 1.2方法特异性 1.3标准曲线 Figure 1. MS spectrum of costunolide, dehydrocostuslactone and IS, the quantifier ions m/z transitions for costunolide, dehydrocostuslactone and IS were 233187, 231185, 285193, respectively. 1.4精密度 1.5稳定性 1.6回收率

  39. 配伍后成分药代动力学 胃肠安丸组方中药味配伍药动学 • 给药后血样中木香烃内酯及去氢木香内酯测定方法的建立。 1.1血浆样品处理方法考察 为了避免血浆中的内源性杂质对所检测血样中木香烃内酯和去氢木香内酯的干扰，实验中考察了不同血浆样品处理方法处理。血浆蛋白沉淀以甲醇、乙腈沉淀除蛋白；液液萃取；固相萃取小柱处理四种方法进行处理，比较萃取回收率及基质干扰。 1.2方法特异性 1.3标准曲线 1.4精密度 固相萃取小柱处理 1.5稳定性 1.6回收率

  40. 配伍后成分药代动力学 胃肠安丸组方中药味配伍药动学 • 给药后血样中木香烃内酯及去氢木香内酯测定方法的建立。 1.1血浆样品处理方法考察 1.2方法特异性 1.3标准曲线 1.4精密度 1.5稳定性 Figure 2. Representative of A and B stand for the blank plasma and blank plasma spiked with the standards. a: MRM spectrums of costunolide; b: MRM spectrums of dehydrocostuslactone; c: MRM spectrums of IS. 1.6回收率

  41. 配伍后成分药代动力学 胃肠安丸组方中药味配伍药动学 • 给药后血样中木香烃内酯及去氢木香内酯测定方法的建立。 1.1血浆样品处理方法考察 Table 1 Statistics results of linear regression equation analysis in the determination of the markers. 1.2方法特异性 1.3标准曲线 1.4精密度 1.5稳定性 1.6回收率

  42. 配伍后成分药代动力学 胃肠安丸组方中药味配伍药动学 • 给药后血样中木香烃内酯及去氢木香内酯测定方法的建立。 1.1血浆样品处理方法考察 1.2方法特异性 Table 2 Precision and accuracy of the assay for costunolide and dehydrocostusl- actone in rat plasma. 1.3标准曲线 1.4精密度 1.5稳定性 1.6回收率

  43. 配伍后成分药代动力学 胃肠安丸组方中药味配伍药动学 • 给药后血样中木香烃内酯及去氢木香内酯测定方法的建立 1.1血浆样品处理方法考察 1.2方法特异性 Table 3 Stability of costunolide and dehydrocostuslactone in rat plasma. 1.3标准曲线 1.4精密度 1.5稳定性 1.6回收率

  44. 配伍后成分药代动力学 胃肠安丸组方中药味配伍药动学 • 给药后血样中木香烃内酯及去氢木香内酯测定方法的建立。 1.1血浆样品处理方法考察 Table 4 Recovery of costunolide, dehydrocostuslactone and IS in rat plasma. 1.2方法特异性 1.3标准曲线 1.4精密度 1.5稳定性 1.6回收率

  45. 配伍后成分药代动力学 胃肠安丸组方中药味配伍药动学 2. 木香药材给药后血样中木香烃内酯及去氢木香内酯药物浓度的测定。 A B Fig. HPLC-MS chromatogram after oral administration of Radix Aucklandiae at 1 h. (A) Costunolide; (B) Dehydrocostuslactone.

  46. 配伍后成分药代动力学 胃肠安丸组方中药味配伍药动学 2. 木香药材给药后血样中木香烃内酯及去氢木香内酯药物浓度的测定 Figure 4. Time-concentration curve for costunolide (A) and dehydrocostuslactone (B) after a single dose of oral administration of RA.

  47. 配伍后成分药代动力学 胃肠安丸组方中药味配伍药动学 2. 木香药材给药后血样中木香烃内酯及去氢木香内酯药物浓度的测定 Table 5. Pharmacokinetic parameters of costunolide (Co) and dehydrocostuslactone (De) after i.g. administration of RA.

  48. 配伍后成分药代动力学 胃肠安丸组方中药味配伍药动学 3. 胃肠安丸全方给药后血样中木香烃内 酯及去氢木香内酯药物浓度的测定。 B A Plasma concentration (ng/mL) Plasma concentration (ng/mL) Time Time Fig. Mean plasma concentration-time profiles of Costunolide (A) ; Dehydrocostuslactone (B) after oral administration of WCA pill.

  49. 配伍后成分药代动力学 胃肠安丸组方中药味配伍药动学 Pharmacokinetics 二、厚朴中厚朴酚及 和厚朴酚药动学 研究 胃肠安丸 厚朴 Honokiol （Ho） Magnolol （Ma）

  50. 配伍后成分药代动力学 胃肠安丸组方中药味配伍药动学 • 给药后血样中和厚朴酚及厚朴酚测定方法的建立。 Pharmacokinetics 2. 胃肠安丸全方不同剂量给药后血样中和厚朴酚及厚朴酚药物浓度的测定。 胃肠安丸 厚朴 Honokiol （Ho） 3. 厚朴酚、厚朴药材及胃肠安丸给药后厚朴酚体内药代动力学比较 Magnolol （Ma）

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