Proteom

1. Proteom

2. GENOME Transcriptome Nucleus Nuclear membrae Proteom Mitochondria Proteome ER Golgi Membrane Vesicles Chloroplasts Vacuole soubor všech proteinů určitého systému - organely, buňky, pletiva, orgánu, organismu - zahrnuje i všechny stavy proteinů (posttranslační modifikace = protein kódovaný jedním genem je přítomen ve více funkčně odlišných formách) - př. u člověka cca 35 tis. genů a odhadem cca 500 tis. různých proteinů (forem proteinů)

3. Faktoryovlivňující proteom buňky Interakce s okolím Fáze buněčného cyklu Teplota ??? Proteome Stres Fyziologický stav buňky Buněčně specifická genová exprese Proteom se dynamicky mění v průběhu buněčného cyklu, vývoje, v reakci na změny v metabolismu, prostředí, … Genom

4. Sledování množství a lokalizace proteinů • Detekce konkrétních proteinů • - Sledování aktivity proteinu (použitelné pouze pro enzymy) • - Imunodetekce - proteinová elektroforéza (SDS-PAGE), Western blot • Studium lokalizace proteinu • - Translační fúze s reportérovým genem (GFP) – viz dříve • (+ transformace rostlinných buněk) • Studium proteomu • Dvourozměrná elektroforéza (2D) • „Gel-free“ metody

5. Imunodetekce konkrétního proteinu Proteinová elektroforéza (SDS-PAGE) Přenos proteinů z gelu na membránu = Western blot detekce proteinu protilátkami (primární = rozeznává detekovaný protein sekundární = rozeznává protilátky z určitého organismu vizualizace pomocí barevné reakce, fluorescence či chemiluminiscence W. blot Sekundární protilátky konjugované s enzymem či fluorescenční značkou Primární protilátka membrána s navázanými proteiny

6. Analýzy celého proteomu nutná separace jednotlivých proteinů (peptidů): – např. 2D elektroforézou (gel-free metody)

7. Princip dvourozměrné (2D) elektroforézy IEF: isoelektrická fokusace SDS-PAGE Každá skvrna představuje jeden protein (při záměně či modifikaci aminokyseliny zpravidla dochází ke změně pI a posunu pozice na gelu)

8. První rozměr IEF • (isoelektrická fokusace): • separace proteinů dle • isoelektrického bodu • proteiny putují do místa, kde pH gelu odpovídá • jejich isoelectrickému bodu (pI), tam ztrácejí • náboj a zastavují se • = dělení proteinů podle náboje vpH gradientu

9. Druhý rozměr SDS-PAGE • separace denaturovaných obalených proteinů dle velikosti v síti polyakrylamidového gelu

10. Princip2-rozměrné (2D) elektroforézy IEF: isoelektrická fokusace + - pH 3 pH 10 - 200 kD SDS-PAGE + 20 kD

11. Barvení proteinových gelů • Coomassie blue • Stříbrem (citlivé, ale není kvantitativní) • Fluorescenční barviva (DIGE) • RI (značení in vivo) DIGE: difference in gel electrophoresis • porovnávání proteomů

12. Analýza proteinových komplexů • dělení nativních komplexů (obalených Coomassie BB) dle velikosti • v gradientovém gelu (gradient koncentrace akrylamidu = hustota sítě) Blue Native Gel Electrophoresis SDS-PAGE

13. Identifikace peptidůhmotovou spektrometrií: 1) „Peptide fingerprinting“ • Naštěpení trypsinem či jinou proteázou (specifické, reprodukovatelné štěpení každé amk sekvence) • př. MS - MALDI/TOF • Matrix-assisted • Laser desorption / ionisation • Time-of-flight analysis

14. MALDI • Matrix-assisted • Laser desorption/ • ionisation ToF Time-of-flight – změření doby letu k detektoru

15. protein I (12 kD) 2 fragmenty (4 kD, 8 kD) protein II (16 kD) 3 fragmenty (2 kD, 6 kD, 8 kD) protein I 4000 8000 m/z protein II 2000 6000 8000 m/z Identifikace proteinů – „peptide fingerprinting” štěpení proteázou (trypsinem) DNA (i EST), proteinová databáze generování teoretických trypsinových štěpů ze známých či předpokládaných proteinových sekvencí MALDI ToF protein a: 3, 5, 9, 12 kD protein b: 2, 7, 9 kD protein c: 4, 8 kD protein d: 3, 9, 12 kD protein e: 2, 6, 8 kD Srovnání experimentálně stanovených velikostí peptidů s teoretickými štěpy

16. 2) MS/MS „sekvenování“ peptidů např. MALDI TOF/TOF (MALDI MS/MS) • Výběr peptidu (na základě primární TOF) • Fragmentace peptidu (kolizní komora s nižším vakuem) • Sekundární ToF analýzavzniklých fragmentů

17. Hmotové spektrum peptidových fragmentů Směs proteinů ----- protein ----- peptid ---------- fragmenty peptidu = identifikace př. 2D trypsin MS/kolize/MS Mascot

18. Přednostní fragmentace peptidové vazby - rozpad na dva fragmenty

19. Analýzy MS spektra

20. iTraq (Isobaric tags for relative and absolute quantitation) „Gel free“ metoda pro hledání a kvantifikace rozdílů v proteomech Postup: - rozštěpení proteinů z každého vzorku na peptidy - modifikace peptidů neovlivňující jejich separaci - každý vzorek jinak, ale různě modifikované peptidy stejné sekvence se chovají při další separaci stejně = „jdou“ společně) - smíchání vzorků, postupná frakcionace - analýza MS/MS - identifikace jednotlivých peptidů - určení poměru jejich množství v jednotlivých vzorcích

21. Schéma modelového experimentu Modifikace aminoskupin iTraq činidly 4-(8) x (každý vzorek jiným činidlem) (každý vzorek samostatně) smíchání frakcionace směsi peptidů MALDI TOF/TOF (identifikace peptidů + zastoupení z jednotlivých vzorků) např. isoelektrická fokusace peptidů LC

22. iTraq značení Ross P L et al. Mol Cell Proteomics 2004;3:1154-1169

23. Identifikace peptidů (fragmentační spektrum) + relativní zastoupení v jednotlivých vzorcích (množství jednotlivých tagů)