Физическая химия биополимеров Лаврик О.И.

1. Физическая химия биополимеров Лаврик О.И. НГУ-2012

2. 12. Вклад рентгеноструктурного анализа в изучение структуры и функции ферментов

3. Метод рентгеноструктурного анализа (РСА) – один из основных методов исследования структуры и функций ферментов и их активных центров Последние 20 лет метод РСА интенсивно развивался благодаря: • улучшению качества очистки белков, • оптимизации методов кристаллизации белков, • улучшению технического оснащения РСА и, в связи с глобальной компьютеризацией, внедрению машинной и компьютерной обработки данных. На заре использования РСА для кристаллизации требовалось порядка 100 мг белка, на сегодняшний день требуется не более 10 мг.

4. Проблемы метода РСА Получение необходимого количества анализируемого белка: • получают рекомбинантную молекулу ДНК, • встраивают конструкцию, кодирующую целевой белок, в клетки E.сoli или бакуловируса, и инициируют направленную экспрессию требуемого белка, • очищают белок от примесей. • Некоторые белки трудно экспрессировать с помощью рекомбинантных молекул, в частности, может возникнуть проблема сборки многосубъединичных белков. • Можно столкнуться с другой трудностью, в процессе очистки целевой белок бывает трудно отделить от примесей без значительных потерь. • Многие белки, качественно очищенные, бывает трудно закристаллизовать.

5. Выявляемые с помощью РСА молекулярные структуры и соответствующее разрешение

6. Панкреатическая рибонуклеаза (РНКаза) Панкреатическая рибонуклеаза (РНКаза) является первым ферментом, для которого У. Стайн и С. Мур в 1960 г. установили полностью первичную структуру. Станфорд Мур 1913, Чикаго - 1982, Нью-Йорк, США биохимик Нобелевская премия по химии 1972 г. Уильям Говард Стайн 1911 – 1980, Нью-Йорк, США биохимик Нобелевская премия по химии 1972 г.

7. Панкреатическая рибонуклеаза (РНКаза) На основании результатов исследования ренатурации рибонуклеазы К. Анфинсен впервые в 1960 г. четко сформулировал представление о том, что пространственное строение белка определяется его первичной структурой. Рибонуклеаза гидролизует межнуклеотидные связи в РНК около пиримидиновых звеньев, которые при этом остаются этерифицированными по 3'-положению. Механизм реакции, катализируемой рибонуклеазой, расшифрован с помощью методов РСА, ЯМР и химической модификации. Кристиан Бемер Анфинсен 1916, Монессен, США - 1995 американскийбиохимик Нобелевская премия по химии 1972 г.

8. Карбоксипептидаза Пространственная структура фермента и его комплекса с дипептидом Gly-Tyr как с моделью субстрата была установлена с разрешением 2 Ǻ в 1967 г. При сравнительном анализе структур фермента и его каталитического прокомплекса с дипептидом Gly-Туг была получена важная информация о строении фермент-субстратного комплекса. В частности, установлено, что при образовании комплекса гидроксильная группа Туг248 перемещается на 1,2 нм по отношению к своему положению в свободном ферменте (т. е. примерно на 1/3 диаметра молекулы). Уильям Липскомб 1919, Кливленд – 2011,Кембридж, США Химик Нобелевская премия по химии 1972 г.

9. Химотрипсин Трехмерная структура химотрипсина с разрешением 2 Ǻ была установлена методом РСА в 1976 г. Первичная структура фермента установлена Б. Хартли в 1964 г. Результаты кристаллографических исследований подтвердили предположение, сделанное с помощью необратимых ингибиторов, о том, что остатки Ser195 и His57 сближены. Следует отметить, что химические исследования не могли выявить участия Asp102 в функционировании активного центра, поскольку этот остаток погружен внутрь молекулы. В настоящее время считается, что три остатка Asp102, His57 и Ser195 образуют систему переноса заряда, которая играет решающую роль в процессе катализа. Дэвид Мэрвин Блоу 1931, Бирмингем – 2004,Эпплдор Английский биофизик

10. Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E. coli Первой ДНК-полимеразой, которая была закристаллизована, был фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E. coli. Фрагмент Кленова лишен 5’-3’ экзонуклеазного домена ДНК-полимеразы I, и обладает двумя активностями: ДНК-полимеризующей и 3’-5’ экзонуклеазной. РСА фрагмента Кленова впервые обнаружил специфическую архитектуру полимеразного домена, который по форме напоминает кисть правой руки и состоит из пространственных доменов «ладонь», «большой палец», прижимающий праймер-матричный двунитевой участок, и «пальцы», которые удерживают однонитевую матрицу. Томас Артур Стэйтц 1940,США биохимик и биофизик Нобелевская премия по химии 2009 г. за структуру большой 50S субчастицы рибосомы

11. Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E. coli Аналогичную трехмерную организацию «правой руки» имеют полимеразные домены других ДНК-полимераз и обратной транскриптазы (ревертазы) ВИЧ. РСА позволяет детализировать и модифицировать эту модель применительно к различным типам ДНК-полимераз эукариот. Наиболее консервативна топология домена «ладонь». В целом, для архитектуры полимеразного домена характерно существование внутренней полости для связывания ДНК и входящего dNTP, основанием которой является домен «ладонь».

12. УФ-излучение мутагены окружающей среды спонтанные реакции эндогенные окислители активные формы кислорода алкилирующие агенты рентгеновское излучение ошибки репликации апуриновые/апиримидиновые (АР-) сайты окисленные дезаминированные и алкилированные основания однонитевые разрывы пиримидиновые димеры крупные аддукты O6-meG двойные разрывы неправильное спаривание оснований вставки, делеции репарация оснований репарация нуклеотидов прямая репарация репарация двойных разрывов ДНК репарация неправильно спаренных оснований Механизмы поврежденийи репарации ДНК

13. Рак Пигментная ксеродерма (меланома, карцинома) Прогрессивный церебральный паралич Синдром Коккейна Умственная и иммунная недостаточность Трихотио- дистрофия Катаракта Старение Дефекты систем репарации ДНК

15. Системы репарации являются мишенями для создания новых лекарств Действие используемых в клинике антираковых препаратов и экзогенных факторов (ионизирующая радиация, цисплатина, алкилирующие агенты) основано на повреждении ДНК и нивелируетсясистемами репарации. Поэтому избирательное ингибирование репарации улучшает терапевтические эффекты.

16. Х Репарация оснований Активные формы кислорода метилирование, дезаминирование Рентгеновское излучение (одноцепочечный разрыв) Поли(ADP-рибозо) полимераза 1 (PARP1) Спонтанный гидролиз гликозидной связи (АР-сайт) ДНК гликозилаза XRCC1 PNK АР-эндонуклеаза 1 (APE1) Pol /ε Pol  XRCC1 PCNA +4dNTP +dGTP FEN1 +ATP ДНК- лигаза I +ATP ДНК- лигаза III

17. ДНК-лигаза III ДНК-лигаза III XRCC1 XRCC1 Pol  Pol  XRCC1 XRCC1 ДНК-гликозилаза АРЕ1 Pol  Репарация оснований ATP dGTP X

18. Первичные дифракционные картины кристаллов Рol β, полученные на лабораторном дифрактометре (А) и на станции «Белковая кристаллография» (Б) . Кристаллографические исследования выполнены ЛБХФ ИХБФМ СО РАН в рамках междисциплинарного интеграционного проекта СО РАН на белковой станции ИЯФ СО РАН (А) и на лабораторном дифрактометре НОЦ МДЭБТ НГУ (Б)

19. Общий вид трехмерных структур комплексовДНК-гликозилаз с модельными ДНК-субстратами • Lau coauth, Cell, 1998, 95, 249–258. • Bruner coauth, Nature, 2000, 403, 859–866. • Parker coauth,Nature, 2007, 449, 433–437.

20. Трехмерная структура комплекса АРЕ1 человека с продуктом катализируемой этим ферментом реакции Показаны две проекции модели (Mol coauth, Nature, 2000, 403, 451–456). Справа – фрагмент схемы репарации ДНК с участием АРЕ1.

21. Трехмерная структура комплекса ДНК-полимеразы β человека с субстратами Приведена структура комплекса с субстратами: дезоксицитидин-5′-трифосфатом и двуцепочечной ДНК, содержащей в одной из цепей однонуклеотидную брешь (Sawayacoauth, Biochemistry, 1997, 36, 11205–11215 ). Справа – фрагмент схемы репарации ДНК с участием ДНК-полимеразы β (Pol β).

22. Структура комплексов восстановленной (А) и окисленной (Б) форм фрагмента XRCC1 с ДНК-полимеразой β (Pol β) Показаны остатки цистеина, ответственные за структурные перестройки разных форм XRCC1, и электростатический потенциал на поверхности соответствующих форм белка (Cuneo and London, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010, 107, 6805–6810).

23. Трехмерные структуры флэп-эндонуклеазы 1 (FEN1) и ДНК-лигазы I в комплексах с ДНК-субстратами А. Chapados coauth, Cell, 2004, 116, 39–50. Б. Pascal coauth, Nature, 2004, 432, 473–478.

24. Трехмерная структура каталитического домена PARP1 Iwashita coauth, FEBS Lett., 2005, 579, 1389–1393.

25. Строение малой субчастицы рибосомыпо данным РСА Полипептидные цепи рибосомных белков выделены разными цветами, полинуклеотидные цепи рРНК показаны серым цветом (Yusupov coauth, Science, 2001, 292, 883–896).