Rostlinné explantáty

1. Charakteristika problematiky, historie Morfogeneze - organogeneze, somatická embryogeneze, somaklonální variabilita Podmínky kultivace: teplota, světlo, vlhkost, složení kultivačních médií, plynná fáze Aseptická kultivace, ošetření mateřských rostlin, typ explantátu Využití explantátů při studiu fyziologie rostlin Vegetativní množení Ozdravování rostlin, umělá semena Tkáňové a buněčné kultury, produkce sekundárních metabolitů, biotransformace Protoplastové kultury, fúze protoplastů, přenos organel, chromozomů Přímý přenos DNA Agrobacterium jako vektor přenosu DNA Budoucnost a rizika využití transgenních rostlin Rostlinné explantáty

2. Problematika bude nahlížena ze dvou hledisek • Řešení situace, kdy budete postaveni před úkol pěstovat kulturu rostlinných explantátů. • K čemu může pěstovaní rostlinných explantátů sloužit, a to jak z pohledu řešení základních otázek fyziologie rostlin, tak z hlediska praktických úkolů. Praktikum obsahuje: • úlohy demonstrující některé základní postupy • Sterilní výsev semen •    Odvození tkáňové kultury • Řízená organogeneze na internodálních segmentech •    Izolace a kultivace meristemu •    Extirpce embryí a jejich kultivace •    Indukce tvorby hlíz na nodálních segmentech •    Somatická a pylová embryogeneze • Kořenové kultury • Přesazení masožravé rostliny

3. Praktikumdále obsahuje: • úlohu:kultivace rostliny podle vlastního výběru • Vybrat rostlinu • v týdnu od 15.října- oznámit rostlinu Dr. Maškové • Vyhledat informace o pěstování vybrané rostliny • v týdnu od 22. října - vyhledání literárních údajů (kniha, Web of Science) • v týdnu od 29. října – vypracovaný přehled informací z literatury a návrh kultivačního protokolu. • Připravit média, připravit rostlinný materiál • Provést kultivaci, sledovat výsledky kultivace • Vypracovat závěrečný protokol • - Úvod: literární údaje • - Materiál a metody: popis zvoleného postupu práce a použitého materiálu, popis podmínek kultivace • - Výsledky: popis průběhu kultivace, výsledky kultivace • - Diskuse: porovnat výsledky s literárními údaji, pokusit se vysvětlit • případné neúspěchy nebo odchylky od předpokládaných výsledků

4. Rostlinné explantáty Co je to rostlinný explantát??? Na čem je založena možnost pěstování R.E.??? • Strategie boje o přežití • mikroorganismy --- počet jedinců v populaci • živočichové --- aktivní boj s podmínkami prostředí • rostliny --- velká plasticita metabolismu, růstu i vývoje vysoká regenerační schopnost – hojení ran, náhrada poškozených orgánů, vegetativní množení Co je podstatou plasticity a vysoké regenerační schopnosti rostlin ??? • Neukončený růst rostlin • zralé buňky • dozrávající buňky • buňky s velkou schopností růst a dělit se – meristemy - produkce nových buněk - zajištění stability genetické informace • Totipotence rostlinné buňky • existence kompletní genetické informace ve většině somatických buněk • možnost její realizace x živočišné b.

5. 1854-1945 1838Schwann a Schleiden - buněčná teorie 1902Myšlenka využití  k regeneraci rostliny z jedné somatické buňky - G. Haberlandt 1902 Gottlieb Haberlandt .. without permitting myself to pose further question, I believe, in conclusion, that I am not making too bold a prediction if I point to the possibility that, in this way, one could successfully cultivate artificial embryos from vegetative cell .. Haberlandt, 1902

6. 1838Schwann a Schleiden - buněčná teorie 1902Myšlenka využití  k regeneraci rostliny z jedné somatické buňky - G. Haberlandt Gottlieb Haberlandt .. without permitting myself to pose further question, I believe, in conclusion, that I am not making too bold a prediction if I point to the possibility that, in this way, one could successfully cultivate artificial embryos form vegetative cell .. ( Haberlandt, 1902) 1854-1945

7. 1838Schwann a Schleiden - buněčná teorie 1902Myšlenka využití  k regeneraci rostliny z jedné somatické buňky - G. Haberlandt Gottlieb Haberlandt .. without permitting myself to pose further question, I believe, in conclusion, that I am not making too bold a prediction if I point to the possibility that, in this way, one could successfully cultivate artificial embryos from vegetative cell .. ( Haberlandt, 1902) • Důvody jeho neúspěchu: • Neznalost působení rostlinných růstových regulátorů • Nevhodný rostlinný materiál – diferencovaná pletiva, jednoděložné rostliny • Nedostatečná sterilizace materiálu 1854-1945 …. Další autoři.. stejné či podobné problémy.. Dosaženo přežívání, i zvětšování objemu buněk, ale ne dělení …. Použití meristematických pletiv ….1. pozitivní výsledky

8. 1838Schwann a Schleiden - buněčná teorie 1902Myšlenka využití  k regeneraci rostliny z jedné somatické buňky - G. Haberlandt 1902 Gottlieb Haberlandt .. without permitting myself to pose further question, I believe, in conclusion, that I am not making too bold a prediction if I point to the possibility that, in this way, one could successfully cultivate artificial embryos form vegetative cell .. ( Haberlandt, 1902) • Důvody jeho neúspěchu: • Neznalost působení rostlinných regulátorů • Nevhodný rostlinný materiál – diferencovaná pletiva, jednoděložné rostliny • Nedostatečná sterilizace materiálu 1854-1945 …. Další autoři.. stejné či podobné problémy.. Dosaženo přežívání, i zvětšování objemu buněk, ale ne dělení …. Použití meristematických pletiv ….1. pozitivní výsledky 1922Haberlandt předpokládá existenci dvou hormonů, které jsou zodpovědné za indukci buněčného dělení, a tak za děje spojené s hojením ran i s různými vývojovými ději.. oplozením, morfogenezí nebo vývojem adventivních embryí

9. 1838Schwann a Schleiden - buněčná teorie 1902Myšlenka využití  k regeneraci rostliny z jedné somatické buňky - G. Haberlandt 1902 Gottlieb Haberlandt .. without permitting myself to pose further question, I believe, in conclusion, that I am not making too bold a prediction if I point to the possibility that, in this way, one could successfully cultivate artificial embryos form vegetative cell .. ( Haberlandt, 1902) • Důvody jeho neúspěchu: • Neznalost působení rostlinných regulátorů • Nevhodný rostlinný materiál – diferencovaná pletiva, jednoděložné rostliny • Nedostatečná sterilizace materiálu 1854-1945 …. Další autoři.. stejné či podobné problémy.. Dosaženo přežívání, i zvětšování objemu buněk, ale ne dělení …. Použití meristematických pletiv ….1. pozitivní výsledky 1922Haberlandt předpokládá existenci dvou hormonů, které jsou zodpovědné za indukci buněčného dělení, a tak za děje spojené s hojením ran i s různými vývojovými ději.. oplozením, morfogenezí nebo vývojem adventivních embryí … we take this anniversary also as an opportunity to remind all of us, that for developing ideas time is needed together with right conditions and atmosphere. Universities in the past used to provide, what now we are risking to lose with our hectic life style and short-term planning.. Laimer M. and Rücker W., 2003

10. Trochu historie 1934kultura kořenů (White) 1935kultivace embryí (La Rue) 1936Gautheret – kultury odvozené z mrkvového kořene (podobně Nobécourt) 1939 dlouhodobě rostoucí kalusové kultury (Gautheret, Nobécourt, White) 1955 objev kinetinu (Miller etal.,) 1957auxin – cytokininový model regulace tvorby orgánů (Skoog a Miller) 1958   regenerace proembryí z kalusové kultury mrkve (Reinert a Steward) 1959enzymatická izolace protoplastů 1962kultivační medium Murashige a Skooga 1965vypěstování rostliny tabáku z izolované buňky 1970protoplastová fúze 1971 regenerace rostlin z protoplastů 1972mezidruhová hybridizace; fúze protoplastů sp. Nicotiana 1973objev Ti –plazmidu 1978somatická hybridizace rajčete a bramboru 1980 použití imobilizovaných buněk k transformaci digitoxinu na digoxin • 1982   inkorporace izolované DNA do protoplastů • transformace listových disků pomocí A. tumefaciens …………………….

11. Trochu historie 1934kultura kořenů (White) 1935kultivace embryí (La Rue) 1936Gautheret – kultury odvozené z mrkvového kořene (podobně Nobécourt 1939 dlouhodobě rostoucí kalusové kultury (Gautheret, Nobécourt, White) 1955 objev kinetinu (Miller) 1957auxin – cytokininový model regulace tvorby orgánů (Skoog a Miller) 1958   regenerace proembryí z kalusové kultury mrkve (Reinert a Steward) 1959enzymatická izolace protoplastů 1962kultivační medium Murashige a Skooga 1965vypěstování rostliny tabáku z izolované buňky 1970protoplastová fúze 1971 regenerace rostlin z protoplastů 1972mezidruhová hybridizace pomocí fúze protoplastů druhů Nicotiana 1973objev Ti –plazmidu 1978somatická hybridizace rajčete a bramboru 1980 použití imobilizovaných buněk k transformaci digitoxinu na digoxin • 1982   inkorporace izolované DNA do protoplastů • transformace listových disků pomocí A. tumefaciens …pěstování rostlinných explantátů je „jen“ možností rozšíření spektra podmínek prostředí … ochrana před patogeny, abnormální fyzikální, chemické podmínky (zejména rovnováha fytohormonů)  rozvinutí okrajových jevů…

13. Přehled doporučené literatury George E.F., Sherrington, P.D.: PlantPropagation by TissueCulture, EasternPress, Eversley,1984 Dixon R.A.: Plant Cell Culture, IRL Press, Oxford, Washington,1985 Bajaj, Y.P.S: Biotechnology in AgricultureandForestry, Vol.2,SpringerVerlag,1986 Pierik R.L.M.: In VitroCulturesofHigherPlants, MartinusNijhoffPublishers, Dordrecht, Boston, Lancaster, 1987 Bhojwani, S.S.: Development in Crop Science, PlanttissueCulture, ApplicationsandLimitatios, Elsvier, 1990 NovákF.J.: Explantátové kultury a jejich využití ve šlechtění rostlin, Academia, Praha, 1990 Kováč J.: Explantátové kultury rostlin, skripta, Univerzita Jana Evangelisty Purkyně, 1992 Ondřej M.: Genové inženýrství kulturních rostlin, Academia, Praha, 1992 George E.F.: PlantPropagation by tissueculture, Exergetics Ltd., England, 1993 Son W.-Y., Bhojwani S.S.: Morphogenesis in planttissuecultures. KluwerAcademicPublishers, 1999 Chawla H.S.: Introduction to plant Biotechnology. Science Publishers, Enfield, New Hampshire, USA, 2002 Laimer M., Rücker W.: Planttissueculture – 100 yearssinceGottliebHaberlandt, Springer-Verlag, Wien, 2003 Slater A., Scott N.W., Fowler M.R.: Plant Biotechnology, Oxford University press, 2008