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第三章 基因工程载体

第三章 基因工程载体. 载体 ：这种能与目的基因结合，且有完整的复制和转录功能的 DNA 大分子称之为载体（ vector ）。. 作为一个理想的载体，应具备以下条件：. （ 1 ）能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制子和启动子，使插入基因复制和表达； （ 2 ）具有多个限制性内切酶的切点，且切点是单一的，这样可将多个外源 DNA 片段插入其中； （ 3 ）具有容易检测的筛选标记； （ 4 ）载体 DNA 的分子量适当，可容纳较大的外源 DNA 片段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝； （ 5 ）在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失。.

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第三章 基因工程载体

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  1. 第三章 基因工程载体 载体：这种能与目的基因结合，且有完整的复制和转录功能的DNA大分子称之为载体（vector）。

  2. 作为一个理想的载体，应具备以下条件： （1）能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制子和启动子，使插入基因复制和表达； （2）具有多个限制性内切酶的切点，且切点是单一的，这样可将多个外源DNA片段插入其中； （3）具有容易检测的筛选标记； （4）载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝； （5）在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失。

  3. 载体的种类： • 克隆载体（cloning vector）：主要是对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可； • 表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子； • 穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。

  4. 第一节 质 粒

  5. 一、质粒的一般特性 • (一) 质粒的分布、大小、数目 • 质粒广泛地分布于原核生物细胞中，也存在于某些真核细胞（酵母的2μ环状质粒）。 • 质粒DNA分子量范围为1—200×106Da。 • 一个细胞内的质粒数量变化也很大，有1至几个的，也有几十个的，甚至有数百个。 （这取决于质粒的复制类型。如果质粒的复制是严紧型的，每个细胞只有1个至几个质拉；如果质粒的复制是松弛型的，每个细胞中质粒有10-200拷贝数。）

  6. (二)质粒DNA的构型 • 三种不同的构型： • 当其两条核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA(cccDNA)，这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型； • 如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA(ocDNA)。 • 若质粒DNA的双链均发生断裂而形成线形分子，则通称为L构型。

  7. 单链切割 连接 单链切割 连接 线性DNA （L型） 开环DNA （oc型） 共价闭合环形DNA （SC型） 环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型

  8. (三)质粒DNA的理化性质 • 质数DNA具有一般核酸分子的理化特性。 • 能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂， • 在一定pH下可解离而带电荷 • 能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。 • 比较能抗切割和抗变性。

  9. (四)质粒DNA的生物学特性 (1)寄生性：质粒只能在宿主的细胞内复制。 (2)稳定性：每种质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。 (3)同源性：不同质粒之间可能存在一定的同源区。 (4)重组性：两种不同的质粒处于同一宿主细胞中或者一种质粒处于一种宿主细胞中，有可能发生质粒与质粒之间或质粒与染色体之间的重组。 (5)不相容性：有相同复制始区的不同质粒不能共存于同一宿主细胞中。该不相容性的分子基础主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。

  10. (6)传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的质粒带有一套与传递有关的基因。(6)传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的质粒带有一套与传递有关的基因。 • (7)消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法将其去除。 • (8)复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制。 • (9)表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的抗性等。

  11. (五)质粒的命名原则 • 1976年提出一种质粒命名的原则，用小写字母p代表质粒，在p字母后面用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称。如pUC118, 字母p代表质粒，UC是构建该质粒的研究人员的姓名，118代表构建的一系列质粒的编号。

  12. 二、组建理想质粒载体必须具备的条件 • (一)质粒拷贝数较高 • 质粒拷贝数是指生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。

  13. 根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成：根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成： • 严紧型 • 松弛型 • 低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有1-3份的拷贝，称这类质粒为“严紧型”复制控制的质粒(stringent plasmid)； • 高拷贝数的质粒，每个宿主细胞中可高达10-60份拷贝，这类质粒被称为“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)。

  14. (二)分子量较小 低分子量的质粒如下优点 • 通常拷贝数较高 • 克隆时所预期的基因表达产物的数量较大 • 限制酶的切点相应减少，有可能找到合适的单一限制酶切点，便于制作酶切图谱。 • 外源DNA容量较大， • 容易转化，当质粒大于15kb时，将成为转化效率的制约因素。 • 遗传工程操作时容易拿捏，容易分离，不易断裂。

  15. (三)带有可供选择的标记 • 常采用的标记是对某种抗生素的抗性，如氨卞青霉素抗性(Ampr)、卡那霉素抗性(Kanr)、四环素抗性(Tetr)等，而且希望各抗性基因内有若干单一的限制酶切点。 • 在克隆时通过单一酶切点插入外源基因，使该抗性基因失活、宿主菌变为对该抗生素敏感的菌株，这样较易检查到克隆是否成功。

  16. β-半乳糖苷酶筛选系统： • 载体上带有一个来自大肠杆菌的lac操纵子的DNA区段，这一区段编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个蛋白片段。IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)可以诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的β-半乳糖苷酶羧基端的一个蛋白片段互补(α-互补)。故暴露于诱导物IPTG的细菌含有编码lacZ的质粒可同时合成该酶的两种片段，该菌在其生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷)的培养基上生长，将形成蓝色茵落。将一连串克隆位点克隆入β-半乳糖苷酶氨基端的基因中，外源DNA插入质粒的多克隆位点后可使β-半乳糖苷酶的氨基端片段灭活，从而破坏了α-互补作用。因此，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。利用这种筛选方法可方便地将含目的基因的重组子从空载体中筛选出来。

  17. 大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统 i P O lacZ β-半乳糖苷酶 调控蛋白P 分解半乳糖

  18. 诱导剂IPTG α-肽段 分解X-gal 产物呈现蓝色 β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15 a-互补显色反应（蓝白斑筛选） lacZ - i P O β-半乳糖苷酶- 调控蛋白P 分解半乳糖

  19. 互补显色反应

  20. (四)带有尽可能多的单一限制性酶切位点 • 单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入； • 较多不同的单一限制酿酶切位点，可有选择地供带有不同末端的外源基因插入。目前常用载体上的多克隆位点(MCS)即具有该功能。

  21. (五)具有复制起始点(origin, ori) • 这是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，也是决定质粒拷贝数的重要元件．可使繁殖后的细胞维持一定数量的质粒拷贝数。 • 例如含ColE1或pMB1复制起始点的质粒即为松弛型质粒。 • 在一般情况下，一个质粒只含有一个复制起始点，构成一个独立的复制子。穿梭质粒含有两个复制子，一个是原核生物复制子、另一为真核生物复制子，以确保其在两类细胞中均能得到扩增。

  22. 三、常用的质粒载体 • pSC101质粒载体是第一个成功用于克隆真核DNA的大肠杆菌质粒载体。 • pBR322是用人工方法构建的符合理想质粒载体条件的好载体，一度曾得到广泛的应用。 • (一)克隆载体

  23. 1.质粒 重要的大肠杆菌质粒载体 pBR322： 松弛型复制 氯霉素可扩增 拷贝数 50 - 100 / cell 用于基因克隆

  24. 2.pUC质粒载体 (1)来自pBR322质粒的复制起点(ori)； (2)氨卞青霉素抗性基因(Ampr)，但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制酶的单识别位点； (3)大肠杆菌β-半乳糖苷酶(lacZ)的启动子及其编码该基因氨基端α-肽链的DNA序列,此结构特称为lacZ1基因； (4)多克隆位点(MCS)区段：位于lacZ 基因中的靠近5’端，内含十几个单一的限制性内切酶识别切割位点，使含有不同粘端的目的DNA片段可方便地定向插入载体中。但它并不破坏lacZ 基因的功能。

  25. pUC18 / 19： 拷贝数 2000 - 3000 / cell 装有多克隆位点（MCS） 正选择颜色标记 lacZ’ 用于基因克隆和测序

  26. pUC18质粒载体 • 优点: • (1)具有更小的分子量 在基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下pBR322的氨卞青霉素抗性基因及复制起点，使其分子大小相应地缩小了许多．如pUC8为2750bp，pUC18为2686bp。 • 更高的拷贝数：pBR322质粒的复制起点内部发生了自发的突变，即rop基因的缺失。由于该基因编码的共63个氨基酸组成的Rop蛋白质，是控制质粒复制的特殊因子，因此它的缺失使得pUC8质粒的拷贝数比带有pMBl或ColE1复制起点的质粒载体都要高得多， • 平均每个细胞即可达500-700个拷贝。所以由pUC8质粒重组体转化的大肠杆菌细胞，可获得高产量的克隆DNA分子。

  27. (2)便于重组子的检测: • pUC18质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用。因此，在应用pUC18质粒为载体的重组实验中，可用X-gal显色法一步实现对重组子克隆的鉴定。

  28. lacZ’ lacZ’ 完整的β-半乳糖苷酶 N端 C端 缺陷型大肠杆菌

  29. pUC18 / 19：正选择标记 lacZ’的显色原理 Plac MCS lacZ’ pUC18/19 5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷 X-gal b a b-半乳糖苷酶的a-肽段

  30. (3)具有多克隆位点(MCS)区段 • pUC18质粒载体具有与M13mP8噬菌体载体相同的多克隆位点(MCS)区段，它可以在这两类载体系列之间来回“穿梭”。因此，克隆在MCS当中的外源DNA片段，可以方便地从pUC18质粒载体转移到M13mp8载体上， • 也正是由于具有MCS序列，可以使具两种不同粘性末端(如EcoRI和BamHl)的外源DNA片段，无需借助其它操作而直接克隆到pUCl8质粒载体上。

  31. pGEM-3Z： lacZ’ PT7 多拷贝 MCS pGEM-3Z PSP6 装有多克隆位点（MCS） 2743 bp Apr 正选择颜色标记 lacZ’ 装有两个噬菌体的强启动子 ori 用于外源基因的高效表达 注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合 酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如： E.coli BL21（DE3）等

  32. (二)表达载体 • 条件：一个强启动子及其两侧的调控序列; • 有SD序列且该序列与起始密码于ATG之间要有合适的距离 • 在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架；外源基因下游有转录终止子等。

  33. 1. pKK表达质粒载体 • pKK启动子为Ptac，由大肠杆菌强启动子Ptrp和Plac杂合组成。 • pKK233-3表达载体含有tac启动子、lacE的RBS、pUC18的多克隆位点，在远端还有一个rrnB的转录终止信号。 • pKK233—2，它的特点是RBS的下游8个核苷酸处有一个ATG序列，该ATG和它的前后核苷酸(CCATGG)一起又组成了Nco I位点，其后又有可供插入用的Pst I及HindIII位点，最后接上rrn B的转录终止信号。

  34. 外源DNA可有3种插人法 ①将Nco I位点切开补齐后与外源DNA平端连接； ②如外源DNA亦含翻译起始ATG，Nco I位点则可直接连接，如为其他位点可加入Nco I接头后连接(使用8，10或12个核苷酸的NcoI接头以获得正确的读码框架)； ③使用Pst I或Hind皿位点，但此时会在表达蛋白的N-末端增加2-5个氨基酸。较新的表达载体是pKK388-I，它亦含有tac启动子及rrnB抗终止序列、RBS以及下游8个核苷酸处的Nco I位点，紧接着是来自pUCl8的多位接头，最后是rrnB的转录终止信号。

  35. 2.融合表达载体系统 • 组成成分： 含有启动子(tac)及lac操纵基因、 SD序列 谷胱苷肽巯基转移酶(GST)基因，而克隆的外源基因则与GST基因相连。当基因表达时，表达产物为谷胱苷肽巯基转移酶与目的基因的融合体。

  36. 该载体具有以下优点： ①可诱导，能高效表达所需基因或基因片段。IPTG可诱导tac启动子进行高效表达。 ②融合蛋白极易纯化。谷胱苷肽巯基转移酶GST分子量为25kDa，作为一种酶在大肠杆菌表达或与外源基因融合表达时，与自然界存在的酶具有相同的酶活性，用亲和层析法(G1utathione Sepharose 4B)极易从裂解液中分离纯化出融合蛋白，也可用显色法或免疫学方法方便地检测外源蛋白的表达量。

  37. ③可方便地从融合蛋白中获取单一外源蛋白。在pGEX多克隆位点上游有一个位点特异的蛋白酶(如凝血酶、prescission protease，Factor Xa)识别和切割位点，可方便地将所需蛋白从融合蛋白中切出并纯化。所以，近年来该系统已广泛地应用于基因表达、分子免疫学、疫苗生产及DNA蛋白质相互作用的研究等。

  38. 第二节噬菌体载体

  39. 一、λ噬菌体 • λ噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。 • 基因组长度：约为50kb的双链DNA分子，实际大小为48502bp。 • DNA是线状双链分子带有单链的互补末端，末端长12个核苷酸，称为粘性末端，简写cos，12个碱基的序列为5'-GGGCGGCGACCT-3'。当噬菌体感染宿主细胞后，双链DNA分子通过cos而成环状。

  40. CCCGCCGCTGGA GGGCGGCGACCT 环化作用 G T C A

  41. 61个基因，每个基因平均为1000bp，其中32个较为重要，它们的分布和排列与其功能有一定关系。61个基因，每个基因平均为1000bp，其中32个较为重要，它们的分布和排列与其功能有一定关系。 图3-1 λ噬菌体基因组结构

  42. 基因组分为几个不连续的区域，三个片段组成：基因组分为几个不连续的区域，三个片段组成： • （1）左臂，19.6kb，含噬菌体头、尾蛋白质编码基因，A～J的12基因都是构成外壳蛋白的基因，其中A～E5个基因与头部形成有关，G～J5个基因与尾部形成有关。 • 噬菌体左右两臂包含了λ复制和成熟所必须的全部机能蛋白编码，而中央片段为非必需区，即位于J基因和N基因之间的片段可被其他大肠杆菌DNA片段所替换。

  43. （2）中央片段，12kb～24kb，含PL控制red和gam基因。（2）中央片段，12kb～24kb，含PL控制red和gam基因。 非必需区

  44. （3）右臂，9kb～11kb，含λDNA复制和溶菌有关的蛋白编码基因。与裂解有关的S和R基因、与DNA复制有关的O基因和P基因等也都分别聚集在一起。（3）右臂，9kb～11kb，含λDNA复制和溶菌有关的蛋白编码基因。与裂解有关的S和R基因、与DNA复制有关的O基因和P基因等也都分别聚集在一起。 非必需区

  45. λ噬菌体感染大肠杆菌后呈现两种类型的生长方式，即溶菌性反应与溶源性反应。λ噬菌体感染大肠杆菌后呈现两种类型的生长方式，即溶菌性反应与溶源性反应。 • 在感染早期，当  噬菌体 DNA 进入宿主细胞后，其两端互补单链通过碱基配对形成环状 DNA 分子，而后在宿主细胞的 DNA 连接酶和旋促酶（gyrase）作用下，形成封闭的环状 DNA 分子，充当转录的模板。

  46. 噬菌体的两条复制途径： • （一）裂解生长： 噬菌体立即进行PL和PR启动子启动的N和ro基因转录。早期转录产生的N蛋白可使RNA聚合酶越过早期终止子而启动O、P和Q基因转录。 O、P产物与复制有关， Q基因蛋白则与噬菌体的头、尾部包装和溶菌有关。 λDNA进入θ复制和滚环式复制，同时进行包装，最后导致细菌溶解，释放出子代噬菌体。经过 40～45min 的生长循环，释放出约 100 个感染性噬菌体颗粒（每个细胞），成熟后使细菌裂解，释放出许多新的有感染能力的病毒颗粒。

  47. （二）溶源性生长： • 感染细菌后，λ噬菌体的cⅠ基因产物λ抑制蛋白结合于OL和OR操纵子，阻断早期转录，λ噬菌体则关闭自己的大部分基因并整合到宿主染色体，然后象细菌染色体上的基因一样进行复制，并传递给下一代细菌。

  48. λ噬菌体的缺陷与改造 λ噬菌体的缺陷： ⑴ 基因组太大（49kb）； ⑵ 酶切点太多，它有5个BamH1位点（G↓GATCC），6个BgⅠ位点（A↓GATCT），5个EcoRⅠ位点（G↓AATTC）。 ⑶野生型只能接纳一定长度的DNA。若相当于λ噬菌体的75-105%，那么只能接纳49kb×5%=2.45kb的DNA。 λ噬菌体的改造 ⑴ 切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更大）； ⑵ 去处太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口； ⑶增加标记基因（remarke gene）。 (4)引入无义突变．

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