Лаборатория молекулярной биологии туберкулеза НИИ биоинженерии ГНЦ ВБ «Вектор»

1. Определение источника возникновения MDR-изолятов на основе анализа лекарственно-устойчивых штаммов M.tuberculosis в Новосибирской и Томской областях Лаборатория молекулярной биологии туберкулезаНИИ биоинженерии ГНЦ ВБ «Вектор»

2. Актуальность проблемы: • Около трети населения нашей планеты инфицировано туберкулезом. • В течение нескольких последних лет постоянно увеличивается количество больных, инфицированных MDR-штаммами M.tuberculosis • Заболеваемость туберкулезом в Новосибирской области составляет 125,4 на 100 тыс. населения, что в 1,41 раза выше общероссийского уровня. • Не выявлен основной механизм распространения MDR-штаммов в популяции больных туберкулезом.

3. Возможные механизмы распространения MDR – штаммов M.tuberculosis • Поскольку у M.tuberculosis не обнаружены плазмиды и отсутствует механизм обмена ДНК между штаммами, единственной причиной возникновения лекарственной устойчивости являются спонтанные хромосомные мутации. Таким образом остается 2 основных механизма: • Селекция спонтанно возникающих мутантных микобактерий в результате неадекватного лечения больного туберкулезом либо при несоблюдении курса лечения больным. • Инфицирование больного извне резистентными мутантными микобактериями.

4. Для выявления доминирующего пути в распространении устойчивых штаммов M.tuberculosisмы планировали: • Провести детекцию мутаций в генах rpoB и katG с помощью биочипов, производства Московского института молекулярной биологии РАН. • Провести генотипирование популяции M.tuberculosisиз Новосибирской области методом IS 6110 Inverse PCR. • Провести генотипирование популяции M.tuberculosis из тюрем Томской области методом MIRU-VNTR. • Выявить наличие корреляции между определенной мутацией и принадлежностью изолята к определенному кластеру. Если взаимосвязь существует, то это говорит в пользу распространения MDR штаммов по пути инфицирования извне. Если взаимосвязь не обнаружится, то это значит, что образование MDR-штаммов идет по пути спонтанного мутагенеза.

5. Определение мутаций в генах rpoB и kаtG методом гибридизации на биочипе • Наработка анализируемого фрагмента ДНК с помощью ПЦР. • Гибридизация реакционной смеси на биочипе. • Детектирование флуоресцентных сигналов после гибридизации. • Обработка сигналов, выявление доминирующих мутаций.

6. Принцип метода генотипирования 6110 Inverse PCR: • Особенностью этого метода является то, что праймеры подбирают к фланкирующим районам IS6110 в такой ориентации, чтобы амплифицировались фрагменты между соседними инсерционными элементами IS6110.

7. Метод MIRU-VNTR • Variable Number of Tandem Repeats • – Frothingham et al • Mycobacterial Interspersed Repetitive Units • – Supply et al

8. Спектр мутаций в гене rpoB, выявленных от 170 больных туберкулезом на территории Новосибирской области

9. Генотипирование 170 изолятовиз Новосибирской области методом IS6110 inverse PCR • Изоляты, входящие в 6-ой и 5-ый кластеры, представлены двумя наиболее распространенными в Новосибирской области генотипами и обладают более высокой трансмиссивностью по сравнению с некластеризующимися изолятами. • Изоляты, образующие кластеры, которые состоят не более чем из 6 изолятов на наш взгляд, обладают недостаточной способностью к распространению в Новосибирской области либо могут быть завезенными штаммами.

10. Спектр мутаций, выявленных в генах rpoB и katG у изолятов от больных из тюрем Томской области • Ген katG • Ген rpoB

11. Результат генотипирования 51 изолята из тюрем Томской области методом MIRU-VNTR • Среди изолятов идентифицировано 28 генотипов. • Процент кластеризации составил 63%, а максимальный размер кластеров не превышал 5 изолятов. • Все проанализированные изоляты образуют 4 близкородственные группы, состоящие из 27, 13, 8 и 3 изолятов.

12. Сравнительная характеристика доминирующих путей возникновения MDR изолятов • Для определения механизмов распространения MDR-штаммов M.tuberculosis нами были проанализированы частоты встречаемости мутаций генов rpoB и katG в кластерах, обнаруженных при анализе 170 изолятов из Новосибирской области, и 51 изолята, полученного из бактериологической лаборатории УИН Томской области. • Статистический анализ достоверности различия средних значений осуществляли с помощью критерия Стьюдента с φ-преобразованием Фишера и поправкой Йетса на непрерывность.

13. В результате анализа достоверности различия частот появления мутаций Ser531Leu в гене rpoB в популяции больных из Новосибирской области, нами установлено: • 1. Частота появления мутаций среди кластеризующихся штаммов M.tuberculosis (66,7%, кластер 2, рис.1) достоверно выше, чем частота у некластеризующихся изолятов (35,9%, кластер 1, рис.1), устойчивых к рифампицину. • 2. Частоты встречаемости мутации Ser531 Leu у изолятов двух доминирующих кластеров 5 и 6 на рис. 1 достоверно выше, чем частоты как у кластеризующихся изолятов (кластер 2), так и в среднем по выборке и составляют 85,7% и 77,7% соответственно. • 3. Сравнение частот встречаемости мутации Ser531  Leu у изолятов двух доминирующих кластеров 5 и 6 не выявил достоверных отличий.

14. В результате анализа достоверности различия частот появления мутаций Ser531  Leu в гене rpo B, и Ser315  Thr в гене katG в популяции, генотипированной методом MIRU VNTR, нами установлено: • 1. Достоверных различий между частотами выявления мутации Ser531  Leu в гене rpoB в различных кластерах не было выявлено. • 2. Частота встречаемости мутации Ser315  Thr в гене katG достоверно выше в кластере №4 рис. 2, чем в среднем в популяции и составляет 96,4%.

15. Результаты использования биочипов для определения устойчивости к рифампицину и изониазиду. • В 85-87% случаев выявление мутации у изолята M.tuberculosisсовпадало с наличием устойчивости, определенным с помощью метода ингибирующих концентраций. • Спектр мутаций в гене rpoB как в Новосибирской, так и в Томской областях ограничен и включает в себя 4 основных мутациис явным доминированием мутацииSer531 Leu • Мы рекомендуем внедрить технологию биочипов в клиническую практику как экспресс метод определения устойчивости к рифампицину и изониазиду

16. Анализ полученных результатов. • Во всех выявленных кластерах нами были обнаружены мутантные штаммы. Видимо, в ходе лечения больных туберкулезом постоянно происходит селекционный отбор устойчивых штаммов M.tuberculosis, образовавшихся в результатеспонтанного хромосомного мутагенеза. • Выявленная связь между кластерами и частотами детектирования мутаций как в гене rpoB, так и в гене katG говорит о преобладающей роли инфицирования первично резистентными микобактериями в распространении MDR –штаммов.

17. Данная работа создана коллективом авторов: *Сивков А.Ю., *Болдырев А.Н., *Азаев М.Ш., *Боднев С.А., **Медведева Е.В., **Баранова О.И., **Ивлев-Дунтау А.П., ***Блинова Л.Н., ****Пасечников А.Д., *Татьков С.И. * Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии “Вектор”, Кольцово, Новосибирская область, Россия **НМУ СМО «ФТИЗИАТРИЯ», г. Новосибирск, ул. Петропавловская, 8, 630034 *** УИН Томской области **** НГО "Партнеры во имя здоровья", Гарвардская Медицинская Школа, Томск, Россия. • Работа поддержана проектами МНТЦ #2019 и #1980

18. Благодарю за внимание.