کنترول کیفی آزمایشهای سرولوژی

1. کنترول کیفی آزمایشهای سرولوژی بنا م خداوند بخشنده مهربان

3. 1. Labeled Immunoassay Enzyme Linked Immuno Sorben Assay ( ELISA ) Radio Immuno Assay ( RIA ) Immuno Flurescent Antibody Technique ( IFAT ) Electrochemilominsance ( ECL ) 2.Non Labeled Immunoassay. Agglutination tests Precipitation tests Fluccolation tests

4. Agglutination Reactions • Direct agglutination • Passive agglutination • Agglutination inhibition Ab + particulate Ag Agglutination (clumping)

5. Example # 2 – Using bacteria (Ag) looking for Ab in serum. Direct agglutination

6. Results when inert particles are coated with soluble Ags which may react with Ab. Particles include latex, rbc’s, charcoal, etc. Example – Ag attached to latex particle (known) + serum looking for (unknown) Ab. If Ab present, you get visible agglutination. Indirect or Passive agglutination

7. Involves the adherence of Ab to inert particles which can then be used to detect the presence of Ag. Example – latex particle coated with Ab (known) + serum looking for (unknown) Ag. If Ag present, then you get visible agglutination. (CRP test) Reverse passive agglutination

8. Agglutination inhibition - pos

9. Agglutination inhibition - neg

10. عوامل موثر در واکنشهای آگلوتیناسیون PH

11. عوامل موثر در واکنشهای آگلوتیناسیون Ionic strength قدرت یونی محیط در حقیقت مولاریته نمکهای محلولی است که آنتی زن و آنتی بادی در آن محلول قرارمیگیرند

12. عوامل موثر در واکنشهای آگلوتیناسیون Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y LATTICE excess antibody excess antigen Amount of lattice Dilution of antibodies

13. نحوه جلوگیری از منفی کاذب در آزمایش CRP • CRP Serum 10 uL Serum 50 uL • < 6 mg / L _ _ • 6 – 20 mg /L _ + • 20 – 200 mg/L + + • > 200 mg/L + _

14. عوامل موثر در واکنشهای آگلوتیناسیون Temperature Cold agglutinin test

15. عوامل موثر در واکنشهای آگلوتیناسیون Incubation time

16. Direct Coombs’ Test

17. Anti-IgG Positive + Anti-C3 Negative - Antibodies to Rh protein, Drug induced warm AIHA (penicillin, methyldopa) Anti-IgG Positive + Anti-C3 Positive + SLE, idiopathic warm AIHA, rarely drug associated 3.Anti-IgG Negative - Anti-C3 Positive + Cold agglutinin disease, Paroxysmal cold hemoglobinuria, rarely warm AIHA if low-affintiy IgG Differential Diagnosis

18. عوامل موثر در تفسير نتايج آزمايشهاي سرولوژي • سن و سابقه قبلي بيمار : تيتر آنتي بادي بيشتر از افراد تازه بيمار شده. • آيا بيمار تاكنون واكسينه شده است: تيتر بالا مربوط به واكسني كه تازه دريافت كرده ، اشتراك آنتي ژن با عامل بيماري جديد، به همان بيماري كه واكسينه گشته است. • وضعيت جغرافيائي محيط: محل شايع و يا آندميك در اين مناطق حد نصاب تيتر قابل قبول براي آن بيماري خاص بالاتر از ساير مناطق مي باشد. • شغل بيمار:تماس مكرر تيتر قابل قبول براي آنها با ساير افراد متفاوت است.موقع بيماري علائم+ افزايش تيتر • قرابت يا تشابه آنتي ژني:افزايش غير معمول آنتي بادي

19. ... • نقص در سيستم ايمني بيمار :كاهش گاماگلوبولين ارثي يا اكتسابي يا بيماري ثانويه _لوسمي –تومورپيشرفته نتايج آزمايشات منفي • موسسه توليد كننده آنتي ژن:حد نرمال و عدم فريز آنتي ژن ها • مصرف دارو:تجويز بي موقع- مصرف كورتون-پرتو درماني • مرحله بيماري :اكثر در اواخر هفته دوم بيماري ظاهر مي گردند • خطا در آزمايشگاه :جواب آزمايش –پي پت آلوده – قرائت نتيجه – مواد فاسد و آلوده

20. Personnel Assay Reported problems Sample Equipment Methods Trouble Shooting

23. بررسی کيفيت کيت ها TP Sensitive = ------------- *100 TP+FN TN Specificity = --------------* 100 TN+FP TP Predictive valve of positive= -----------* 100 TP+FP TN Predictive valve of Negative= ------------* 100 TN+FN

24. Variables that affect the quality of results • The educational background and training of the laboratory personnel • The condition of the specimens • The controls used in the test runs • Reagents • Equipment • The interpretation of the results • The transcription of results • The reporting of results

25. The Impact of Prevalence on Predictive Value DISEASE Absent Present Positive predictive value a = 45 = 90% a+b 50 5 Positive 45 b a c d TEST 5 45 Negative predictive value d = 45 = 90% c+d 50 Negative Sens = 45/50 i.e. 90% Spec = 45/50 i.e. 90% Prevalence = 50%

26. Different of Cold Autoantibodies

27. Cold Auto Antibodies (IgM) • IgM directed against ‘Antigen I’ on red cells • Seen in • Elderly • Lymphomas • Infections - EBV, mycoplasma • DAT (Coombs) - + for C3, negative for IgG • Treat - stay warm

28. Warm AIHA - Treatment • Folic acid supplementation • Steroids • Splenectomy • Immunosuppressives • Cyclophosphamide • Azathioprine • Intravenous immune globumin (IVIG) • Plasmapheresis

29. Differential Diagnosis • Anti-IgG Positive + Anti-C3 Negative - • Idiopathic Warm AIHA, Drug induced warm AIHA (penicillin, methyldopa) • Anti-IgG Positive + Anti-C3 Positive + • SLE, idiopathic warm AIHA, rarely drug associated 3. Anti-IgG Negative - Anti-C3 Positive + • Cold agglutinin disease, Paroxysmal cold hemoglobinuria, rarely warm AIHA if low-affintiy IgG

30. Antibody and antigen can form a lattice Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y LATTICE excess antibody excess antigen Amount of lattice Dilution of antibodies

31. c. Applications These include detection of anti-rhesus factor (Rh) antibodies. Antibodies to the Rh factor generally do not agglutinate red blood cells. Thus, red cells from Rh+ children born to Rh- mothers, who have anti-Rh antibodies, may be coated with these antibodies. To check for this, a direct Coombs test is performed. To see if the mother has anti-Rh antibodies in her serum an Indirect Coombs test is performed.

32. patient red cells + AHG = agglutination

33. Flocculation tests • Flocculation tests for Ab detection are based on the interaction of soluble Ag with Ab, which results in the formation of a precipitate of fine particles. (Ag consists of lipid type particles) • Examples VDRL & RPR’s. (See syphilis tests – to follow)

34. Concentration of Ag and Ab also affects agglutination reactions, both the first and second stages.

35. Low Affinity High Affinity Ab Ab Ag Ag Affinity • Strength of the reaction between a single antigenic determinant and a single Ab combining site Affinity = ∑ attractive and repulsive forces

36. Y Y Y Y Y Y Y 104 106 1010 Keq = Avidity Affinity Avidity Avidity • The overall strength of binding between an Ag with many determinants and multivalent Abs

37. Cross reactions Anti-A Ab Anti-A Ab Anti-A Ab Ag B Ag C Shared epitope Similar epitope Ag A Cross Reactivity • The ability of an individual Ab combining site to react with more than one antigenic determinant. • The ability of a population of Ab molecules to react with more than one Ag

38. آب مصرفي آزمايشگاه • نوع 1:هدايت الكتريكي 1o.< ميكروزيمنس بر سانتي متر مكعب جهت كشت سلولي تهيه Standard • نوع 2:هدايت الكتريكي 1 < ميكروزيمنس بر سانتي متر مكعب براي آزمايشات • نوع 3 :هدايت الكتريكي 10 < ميكروزيمنس بر سانتي متر مكعب جهت شست وشو و غيره • دستگاه مربوطه :Conductometer جهت مقاومت هر چه مقاومت بيشتر باشد آب خالص تر است يعني آبي كه 10 مگااهم مقاومت ، داشته باشد خالص تر است. از 5 اهم يا كمتر

39. كنترل آب مقطر • A :يك قطره روي لام • B :جهت تشخيص كلر+ كمي نيترات نقره آب آلوده به كلر كدر میشود. • C :مواد آلي در يك بالن ژوژ 500 ميلي ليتري 1CC ، SO4H2 غليظ + 3% از محلول پر منگنات پتاسيم 10/1 نرمال اگز بعد از 1 ساعت رنگ ثابت ماند آب د يونيزه است ولي اگر رنگ پر منگنات از بين رفت آب آلوده به مواد آلي است.

40. سانتريفورژ • نوع 1:سطح رسوب افقي است، عيب گرما توليد مي كند. • نوع 2:سطح رسوب مايل زاويه 40-25 درجه سرعت زيادتر از نوع1 و زودتر مي ايستد. • نوع 3:اولترا سانتريفوژ ضمناً • سانتريفوژ با دستگاه تاكامترهر 3 ماه يكبار چك مي شود و تا 5% خطا اشكال ندارد.

41. برنامه هاي اطمينان از كيفيت • تست بايد داراي صحت و دقت كافي باشد. • روش كار –سرعت – هزينه –اهميت و نقش آزمايش در كارهاي كلينيكي. • جهت رسيدن به كيفيت مطلوب بايستي با پزشك ارتباط برقرار نمود . • آيا نتيجه تست صحيح است. • آيا وقتي تكرار شود نتيجه مناسبي بدست مي آيد. • آيا براي استفاده پزشك در درمان از سرعت كافي برخوردار است. • آيا هزينه و استفاده بيمار جهت درمان منطقي است .

42. منابع خطا • فردي –تجربه –آموزش – شرايط استخدامي • عوامل محيطي فضاي كار – نور – تهويه – دما- سروصدا زياد- عدم ايمني • نمونه ها روش و زمان نمونه برداري –انتقال –ذخيره-آماده سازي • حمل ونقل • مواد آزمايشگاهي –كيفيت مواد- ظروف شيشه اي –رنگها • روش انجام تست (آسان –سخت) • دستگاه : غير استاندارد-نتايج غيرق • قابل اطمينان مي دهند • قرائت آزمايش: قرائت عجولانه • گزارش نتيجه : نظم –تكرار

45. Direct agglutination