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荧光显微镜. 徐辉 54237189 smxz@shmu.edu.cn. 荧光显微镜. 染色法 根据:标本的透光率差异 用于:常规明场显微镜 物理法 根据:折射率的差异双折射 用于:相差、微分干涉和偏光显微镜 荧光法 根据:荧光特性 用于:荧光显微镜. 荧光显微镜. 什么是荧光?. 当一个物体吸收了紫外光或者短波光的能量,它能发射出比原来吸收的波长更长的光的特性。这种现象称为“荧光”或“磷光”。. 荧光显微镜. 荧光的特性:. 一.为了能发射出荧光,一种物质必须能吸收进一种
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荧光显微镜 徐辉 54237189 smxz@shmu.edu.cn
荧光显微镜 • 染色法根据:标本的透光率差异 • 用于:常规明场显微镜 • 物理法 根据:折射率的差异双折射 • 用于:相差、微分干涉和偏光显微镜 • 荧光法 根据:荧光特性 • 用于:荧光显微镜
荧光显微镜 什么是荧光? 当一个物体吸收了紫外光或者短波光的能量,它能发射出比原来吸收的波长更长的光的特性。这种现象称为“荧光”或“磷光”。
荧光显微镜 荧光的特性: 一.为了能发射出荧光,一种物质必须能吸收进一种 光线。 二.通常,荧光波长是长于吸收光的波长。 三.每一种物质都有他特定的荧光光谱。 四.通常,荧光强度总是远低于激发光。 五.与激发光的方向无关,荧光向空间各个方向发射。 六.荧光有衰退的特性。
荧光显微镜 荧光染色分类: • 自发荧光 • 二次荧光 • 抗体荧光技术
荧光显微镜 自发荧光(不加染色) 有些物质不加染色,也能发出荧光(自发荧光或原发荧光),但在医学和生物学领域中,只有很少物质具有自发荧光。
荧光显微镜 二次荧光(用化学染色) 非荧光性的物质(蛋白质、炭水化合物)用荧光色素染色,由荧光色素产生荧光(二次荧光),以便进行观察。对特定物体选择合适的荧光色素,该物体就能和周围的组织或细胞区别出来而可以观察到。
荧光显微镜 抗体荧光技术(用免疫染色) 利用特定的抗原必然和特定的抗体相结合这一个事实,有意识地使带荧光标记的抗体和标本中的抗原进行抗原/抗体反应,这样两者的结合体就能通过抗体的荧光观察到。
荧光显微镜 荧光显微镜的原理
荧光显微镜 光源:光源辐射出各种波长的光。 由于荧光和激发光相比,是非常微弱的,因此荧光显微镜的光源强度必须很高,即使在近紫外区,也必须有足够的强度。为了满足这些要求,通常采用高压汞灯,但有时为了特殊需要,也采用卤素灯。
荧光显微镜 荧光激发滤色块 透过能使标本产生荧光的特定波长的光,同时阻挡对激发荧光无关的光。 几种主要的荧光激发滤色块
荧光显微镜 荧光标本: 一般用荧光色素染色或免疫荧光的方法。 阻挡滤光镜: 阻挡掉没有被标本吸收的激发光,有选择地透射荧光。在荧光中也仅有部分波长被选择透过。
荧光显微镜 光学暗视场: 通常荧光的强度和激发光相比,是极微弱的,如果荧光和激发光相叠加,反差就会极度减弱。因此,必须把激发光和荧光彻底地分离出来。
荧光显微镜 荧光显微镜的分类: 一.透射荧光显微镜: 光源:高压汞灯或卤素灯。 聚光镜:使用暗场聚光镜,使激发光和荧光分离出来。 物镜:可用任何种类的物镜。 标本:因为是透射观察,薄的标本比较适合。
荧光显微镜 透射荧光显微镜 优点: • 由于用了暗场聚光镜,激发光不能进入物镜,因此容易形成暗的背景,得到良好的反差。 • 由于上述同样的原因,任何物镜都可用于观察。 • 用低倍物镜时,比反射荧光显微镜更亮。
荧光显微镜 透射荧光显微镜 缺点: • 必须正确调整聚光镜中心和高度,否则不能获得明亮的荧光像。 • 由于暗视场聚光镜焦距限制,不能使用厚的载玻片。 • 视场照明区不能过大,否则容易使荧光标本荧光色衰褪。 • 厚的或不透明的标本不适用。
荧光显微镜 反射荧光显微镜 的光学原理
荧光显微镜 荧光显微镜的分类: 二.反射荧光显微镜: 光源:高压汞灯或卤素灯。 聚光镜:因为物镜作为聚光镜,所以不需要聚光镜。 物镜:所用的物镜必须能透过足够的紫外光,而且本身不产生荧光,对数值孔径没有限制。 标本:厚的标本或不透明的标本都能观察。
荧光显微镜 反射荧光显微镜 优点: • 由于物镜兼作聚光镜,不需要很多调节。 • 采用柯拉照明法,可利用孔径光阑和视场光阑的效果。 • 物镜数值孔径不受限制,在高放大被率时,也可以获得高分辨率的像。 • 厚的或不透明的标本也能观察,厚的盖玻片也能使用。 • 其它观察法也能与反射荧光结合使用,特别和相差法和透射微分干涉差法相结合。 • 可以避免不必要的荧光色衰褪现象。
荧光显微镜 反射荧光显微镜 缺点: • 在用低倍率物镜时,像比较暗,因此必须用大数值孔径的物镜。 • 滤光镜系统必须有效地分离开激发光和荧光。
荧光显微镜 荧光显微摄影技术 • 选用正确的激发滤色块 • 采用柯勒照明法 • 曝光时一般采用1%点测光 • 摄影采用高感度软片
荧光显微镜 荧光显微摄影技术 • 荧光有衰退的特性 • 视场光阑和光闸的使用 • 照相系统的使用 • 标本和底片的正确保存
荧光显微镜 荧光显微数码摄影技术 • 需特殊的设备。 • 一般用手动曝光。
荧光显微镜 谢 谢 !