微生物学实验

1. 微生物学实验 兰州理工大学 生命科学与食品工程实验教学

2. 实验一 细菌形态结构观察和光学显微镜的使用 显微镜概述 微生物的个体微小，必须借助显微镜才能观察到。因此，显微镜就成为微生物学研究工作者不可缺少的基本工具。所以，了解显微镜的种类、结构、功能和正确地掌握不同显微镜的使用方法是很有必要的。 显微镜可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。光学显微镜有普通光学显微镜、相差显微镜、微分干涉差显微镜、暗视野显微镜、紫外光显微镜、偏光显微镜和荧光显微镜。下面主要介绍普通光学显微镜。

3. 一、目的要求 • 1.学习显微镜的结构、功能和使用方法。 • 2.学习并掌握油镜的原理和使用方法。

4. 二、显微镜的基本结构及油镜的工作原理 普通生物显微镜由3部分构成： • ①照明系统：包括光源和聚光器。 • ②光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显微镜的主体。 • ③机械装置：用于固定材料和观察方便，包括镜台(载物台) 、调节器和、物镜转换器(旋转器)。 尼康E-600显微镜 基础知识

5. 与其他物镜不同，油镜需在载玻片与镜头之间加滴镜油，原因有二：与其他物镜不同，油镜需在载玻片与镜头之间加滴镜油，原因有二： • 1.增加照明亮度 油镜的放大倍数可达100x，教具很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。为了不使通过的光线有所损失，必须造又精于加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的镜油。通常用香柏油（n=1.52）. • 2.增加显微镜的分辨率 油镜的分辨率可达到0.2μm左右。

6. 2.荧光显微镜 荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色） 尼康E800荧光DIC显微镜

7. 3. 激光共聚焦扫描显微镜 LCSM照片 蓝色为细胞核，绿色为微管

8. 4.暗视野显微镜 暗视野显微镜（dark field microscope）的聚光镜中央有当光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4-200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。 一种介壳虫的染色体

9. 5.相差显微镜 • 6. 偏光显微镜 • 偏光显微镜（polarizing microscope）用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。

10. 7.微分干涉差显微镜 DIC显微镜其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。 DIC显微镜下的硅藻 （伪彩色）

11. 8. 倒置显微镜

12. 9. 透射电子显微镜 莱卡超薄切片机 JEM-1011透射电子显微镜

13. 内质网透射电镜图（伪彩色） 冰冻蚀刻电镜照片

14. 10. 扫描电子显微镜 人类血细胞SEM照片 JEOL扫描电子显微镜

15. 11. 显微操作技术 尼康NT-88NE显微操作/注射仪

16. 显微镜的分辨率: 也称为分辨力，它是指能把两个物点辨清的最小距离， 分辨距离越大，则分辨率越低。所以，分辨率是以分辨 距离来表示的。 其计算公式为: D=0.61入/N·A N·A·=n · sina/2 式中D为分辨率，A为光波波长，N·A·为物镜的数值孔径(镜口率)。

17. 在物镜上，有镜口率(N.A.)的标志，它反应该镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨率越高，各物镜的镜口率如下表： 物镜 镜口率(N.A.) 工作距离(mm) 10× 0.25 5.40 40× 0.65 0.39 100× 1.30 0.11

18. 显微镜的总放大倍数等于目镜和物镜放大倍数的乘积，显微镜的总放大倍数等于目镜和物镜放大倍数的乘积， • 公式为: M = K1xK2 • 焦点深度: 显微镜调焦到看清标本某一点时，不仅是这一物点，而且它的 • 上下两侧也能看清楚两侧的厚度叫做焦点深度。看到标本的全 • 厚度，必须调节螺旋仔细地从上到下进行观察。

19. 厚标本和薄标本 4 - 5 um 2um 基础知识

20. 三、 实验步骤 • (一) 显微镜的使用 • 1. 观察前的准备工作 • (1)观察者要养成显微镜镜检的工作习惯，观察时要双眼同时睁开，一边观察一边进行记录或描绘。 • (2)观察时所用的材料、药品和各种器具要预先准备好。 • (3)显微镜在使用之前应检查一下它的各个部件是否完整和正常，并对载物台、目镜、物镜以及聚光器上端透镜进行必要的清洁工作。然后进行合轴调节。

21. 2. 显微镜的调节 瞳 距 调 节

22. 屈 光 度 调 节 调节

23. 粗 调 松 紧 调 节 旋 钮

24. ① 标本 ②10X物镜 ③ 孔径光栏 ⑤ 光轴中心调节螺钉 ④ 聚光镜升降旋钮 ③ 视场光栏 聚 光 镜 中 心 调 节

25. N.A聚=(0.6-0.8)N.A物 孔径光栏调节

26. 100% 70% 30% 孔径光栏开度与图象

27. 孔径光栏的运用

28. 操作步骤如下: (1）可变光栏的中心对准聚光镜的中心。如果可变光栏的水平是固定的，则装配时已保证它与聚光镜合轴，不必调整;如果可变光栏的水平位置可以移动，则应把可变光栏关到最小，使它的中心孔对准聚光镜下方的透镜中心。 (2)载物台上放置观察标本，把聚光器上升到它上端透镜平面稍低于载物台平面的高度，并将它的可变光栏开到最大，用低倍物镜，进行调焦到能看见标本，可调反射镜使视野得到最亮和最均匀 的照明，或把光栏关小，最亮的照明区正处在视野的中央。 (3)转到高倍镜，并调焦到看清标本，然后去掉标本，拔出目镜，眼睛直接向镜筒观察，并把可变 光栏关小，看其亮点是否在视野中心，如果不是，就要转动聚光器的调节螺旋，把亮点调到视野中 央，再慢慢开启可变光栏，使视野看到光栏边缘和聚光镜的边缘相接为止。

29. 3. 观察操作 (1) 低、高倍镜的使用: 先把低倍的物镜用粗调焦螺旋下降至离盖玻片0.5cm处，然后一边观察视野一边上升物镜，直至看到图像，再将标本移到视野中心，用细调焦螺旋把物镜调至最清晰处，若要用高倍镜观察时，把所要进一步放大观察的部位移至视野中央，直接顺时针转换成高倍物镜，然后用细调焦螺旋调焦，至看清物像。

30. 四、 注意事项 1.低、高倍镜的使用。 2.合轴调节。 五、 实验结果 1.熟练显微镜的调节。

31. 六、 思考题 • 1.使用油镜时，为使么选用香柏油或液体石蜡作为物镜与玻片间的介质？其他液体行吗？ • 2.油镜用毕后，为什么必须把镜油擦净？用过多的二甲苯或用酒精擦镜有什么危害？ • 3.什么是物镜的同焦现象？他在显微镜观察中有什么意义？ • 4.观察时为什么要用左眼，并且两眼都应睁开？

32. 实验二 细菌形态构造的染色观察 一、实验目的 1、掌握革兰氏染色、芽孢染色的原理及方法； 2、初步认识细菌的形态构造； 3、进一步熟练显微镜的使用方法。

33. 二、材料与仪器 1、菌种： 大肠杆菌约1d、枯草芽孢杆菌2 d、枯草芽孢杆菌12-20h的 营养琼脂斜面培养物； 2、染色液：革兰氏染色液、 5%孔雀绿溶液、0.5%番红水溶液； 3、仪器：显微镜、载玻片、酒精灯等。

34. 三 、实验原理（革氏染色法） 1、革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的重要鉴别染色法，通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G+)和革兰氏阴性菌（G-）两大类。 2、制片（涂片，干燥，固定）→初染（结晶紫、水洗）→媒染（加碘液覆盖涂面）→脱色（95%酒精、水洗，）→复染（蕃红复染、水洗）→干燥→镜检

35. 革兰氏染色与细胞壁： 外膜蛋白 肽聚糖 外膜 周质空间

36. 四、实验步骤 1、革兰氏染色 1、用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染 2、用碘溶液进行媒染，其作用是提高染料和细 胞间的相互作用从而使二者结合得更牢固。 3、用乙醇或丙酮冲洗进行脱色。在经历脱色后 仍将结晶紫保留在细胞内的为革兰氏阳性细 菌，而革兰氏阴性细菌的结晶紫被洗掉，细 胞呈无色。 4、用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对 涂片进行复染。例如番红，它使原来无色的 革兰氏阴性细菌最后呈现桃红到红色，而革 兰氏阳性细菌继续保持深紫色

37. 革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌

38. 革兰氏阴性菌 革兰氏阳性菌

39. 2、芽孢染色 原理：细菌的芽孢壁致密，透性低，着色和脱色都比营养细胞困难。因此，一般采用碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽抱都同时染上色后，再用蒸馏水冲洗，脱去菌体的颜色，但仍保留芽饱的颜色。并用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可以在显微镜下明显区分芽饱和营养体的形态。

40. 步骤： 1、制片:按常规制片、干燥、固定。 2、染色：加数滴孔雀绿染液于涂片上，用木夹夹住载玻片一端，微火加热至冒蒸汽时，保持5min。切勿让涂片干枯。 3、水洗至流出的水无色为止。 4、复染：用番红染液复染2min。 5、水洗：用缓流水洗后，吸干。 6、镜检：干后油镜观察。芽孢为绿色，芽孢囊及营养体为红色。

41. 芽孢 芽孢囊 枯草芽孢杆菌的染色涂片

42. 五 、注意事项 1、注意涂片不宜过厚； 2、火焰固定温度要适宜； 3、注意控制好脱色程度。

43. 六 、思考题 1、造成革兰氏染色结果不正确（假阴性或假阳性）的主要原因有哪些？ 2、在镜检时，如图片中的细菌呈红色，能否断定该细菌就是革兰氏阴性菌？ 3、用简单染色法是否能观察到细菌的芽孢？为什么？ 4、若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，什么原因？

44. 实验三 酵母菌的形态观察 一、教学要求 学习并掌握形态观察及死活细胞的鉴别方法。 二、实验原理 酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比细菌大几十倍甚至十几倍。大多数以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验是通过美蓝染液水浸片和水—碘液水浸片来观察酵母的形态和出芽生殖方式。

45. 美蓝是一种无毒的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色，借此即可对酵母菌的死活细胞进行鉴别。美蓝是一种无毒的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色，借此即可对酵母菌的死活细胞进行鉴别。

46. Scanning electron micrograph of the common baker's and brewer's yeast Saccharomyces cerevisiae. Note the budding division and previous bud scars.

47. 三、材料与器材 • 菌种: 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） • 麦芽汁（或豆芽汁）斜面培养物。 • 试剂：0.05％ 和0.1 吕氏碱性美蓝染色液，革兰氏染色用碘液 • 显微镜，玻片等

48. 四 、操作步骤 1、菌种活化 将酵母移种至新鲜的麦芽汁琼脂斜面上，25~28℃培养48 h左右备用。 2、美蓝镜片的观察 1）在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色掖，然后按无菌操作用接种环挑取少量酵母菌苔放在染液中，混合均匀。

49. 2）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。2）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。 • 3）将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。 • 4）染色约0.5h后再次进行观察，注意死活细胞数量是否增加。

50. 5）用0.05%吕氏碱性美蓝染液重复上述操作。 • 3、水一碘液镜片的观察 • 在载玻片中央加一小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌苔放在水一碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。