Emissão de luz

1. Emissão de luz • Luminescência • Fluorescência • Fosforescência • Quimioluminescência • Bioluminescência

2. Luminescência é o termo que se usa quando a energia da excitação provém da absorção de fótons. Inclui a Fluorescência e a Fosforescência. Quimiluminescência é um termo geral para produção de luz quando a energia de excitação é proveniente de uma reação química. Bioluminescência é a denominação de um fenômeno de  quimiluminescência onde a reação química é realizada em um organismo, como o vaga-lume por exemplo.

3. Quimioluminescência

5. A fluorescência é uma forma de fotoluminescência em que a emissão de luz desaparece tão logo cessa a absorção da radiação excitadora. (O tempo de vida de uma fluorescência é da ordem de 10-8 s). Fosforescência é semelhante a fluorescência sendo que o produto excitado é mais estável, de forma a demorar mais tempo (de um microsegundo até minutos) até que a energia seja liberada totalmente. Esse fenômeno está relacionado com o fato dos interruptores de tomada em sua casa brilharem no escuro. Em seu polímero, são colocados pigmentos de fósforo, um elemento que possui propriedades fosforescentes. Não é por nada que o nome "fósforo", elemento químico de número atômico 15, vem do grego, phosphoros, que significa "aquele que brilha", ou "o que conduz, traz a luz".

6. Absorção de um fóton e excitação de um elétron . Inicialmente, os elétrons em átomos ou moléculas estão energeticamente em um nível “normal” de energia denominado de estado básico ou estado fundamental (“ground state”). A absorção de um fóton por uma molécula de clorofila excita um elétron, levando ele de um estado de baixa energia (não excitado) para um estado excitado.

7. Fluorescência - bases

8. Iodeto de Propídio Marcador de DNA Moléculas Fluorescentes Fura-2 Indicador de Ca2+

9. Fluorescência - espectros

10. Mecanismo • 1o passo : Absorção (ou excitação) • 2o passo: Dissipação (VR, ISC, CI, NRET, Complexação) • 3o passo: Emissão • Fluor ou Fosforescência • Estacionária • Resolvida no tempo • Polarizada ou não

11. h h h h h Luminescência h h h Molécula no estado fundamental Molécula no estado excitado Excitação h Emissão 10-15 s 10-12 a 102 s VR, ISC, CI, CE, NRET, complexação

12. Características Instrumentais

13. Mecanismo • O elétron excitado primeiramente relaxa ao menor nível do estado excitado, emitindo radiação infravermelha, isto é calor. Após ele retorna ao estado fundamental, podendo neste retorno acontecer três processos: a) perda de calor; B) emissão de um fóton (fluorescência) ou c) transferência de energia a uma molécula adjacente, onde outro elétron é excitado. Este processo é conhecido como transferência por ressonância, conforme. Esse é o mecanismo pelo qual a energia coletada por dezenas ou centenas de moléculas de pigmento podem ser canalizadas a um centro de reação.

14. Absorção de um fóton e excitação de um elétron, com liberação de calor

15. Retorno do elétron excitado ao estado fundamental e os três processos que podem ocorrer neste retorno.

16. A transferência por ressonância pode ser demostrada através de um pêndulo.

17. Sobreposição de absorção e emissão - antraceno

18. Auto-absorção – antraceno

19. Moléculas Fluorescentes • Geralmente aromáticas polianelares (rígidas) • Não possuem grupos muito móveis (dispersam energia) • Vários rendimentos quânticos (eficiência na produção de luz)

20. Rendimento Quântico • Ф = no de fótons emitidos • Aumenta com o número de anéis (<rotação) • Diminui com o aumento da T e com a diminuição da viscosidade (>no colisões) no de fótons absorvidos

21.  Picos do pireno

22. Microscópio de Fluorescência Filtro de emissão Molécula fluorescente Anti-Rabbit IgG Anti-a-tubulina (Rabbit) Tecido fixado Filtro de excitação Luz branca

23. Método de “Polarização” • Lentes de um par de óculos polarizadores dão efeitos fantásticos a um microscópio básico • Ex: Cristal entre o polarizador e o analisador. Gama de cores gravada rodando o polarizador.Técnica usada nas pesquisas mais caras

24. Outros métodos de melhoramento óptico • Contraste diferencial Organelos em 3D Maior realidade • Fluorescência (marcação de estruturas celulares e identificação de estruturas vivas)

25. Células endoteliais de artéria AC: anti-a-tubulina Agente Fluorescente: Alexa Fluor 568 lexc: 500 - 600 lem: 580-660

26. Quando o IP se interacala entre as bases do DNA a fluorescência aumente de 20 a 30 vezes e o pico de emissão é deslocado 40nm para o vermelho. Cromossomo humano em metáfase Iodeto de Propídio (complexado com o DNA) lexc: 480 - 560 lem: 600-700

27. Núcleo F-actina Mitocôndria lem: 520 lem: 599 lem: 461

28. F-actina lem: 520 Mitocôndria lem: 599 Núcleo lem: 461 Sobreposição micrótúbulos e mitocôndrias!

29. Vermelho: Microtúbulos Verde: Fibras de actina Mitochondrion-selective MitoTracker Red CMXRos Microtubules were labeled with mouse monoclonal anti–-tubulin antibody, biotin-XX goat anti–mouse IgG (H+L) antibody and Cascade Blue NeutrAvidin.

30. Filamentous actin (F-actin) magenta. Lipophilic regions of the cell, including intracellular membranes, were stained with green-fluorescent DiOC6(3). Nuclei DAPI blue-fluorescent Bovine pulmonary arterial endothelial cells

31. Degradação foto-induzida (“Photobleaching”) Alexa Fluor Fluorescein 0 30 90 210 s

32. Marcadores Funcionais - pH Fenolftaleína BCECF

33. Marcadores Funcionais - Ca2+ Fura-2

34. GFP - Proteína Fluorescente Verde Viva as águas vivas!