基因克隆过程主要包括 1 、目标片段的获得 2 、重组体载体的构建 3 、寄主细胞的转化 4 、重组克隆的筛选

1. 第四节 基因克隆的策略 基因克隆过程主要包括 1、目标片段的获得 2、重组体载体的构建 3、寄主细胞的转化 4、重组克隆的筛选

2. 目标DNA 片段的获得（常用的方法） 1.直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库(genomic DNA library)，从中调用目的基因； 2.以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立cDNA文库； 3.利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段。 4.化学合成

3. 一、目标DNA 片段的获得 1 ．化学法直接合成用于克隆的目标DNA片段（或是基因）完全可以通过化学法直接合成。 优点：任意创造和修饰基因，可以方便地设置各种接头以及选择各种宿主生物喜好的密码子。 缺陷：易造成中性突变，从蛋白质的氨基酸顺序去推测DNA序列时，不同生物间密码子的偏好及简并性会影响到合成序列的准确性与基因表达．

4. 2 ．从基因文库中钓取目标DNA片段 用于克隆的DNA片段可以是从基因组文库中获得的基因片段，也可以是从cDNA文库中获得的cDNA片段。 关于文库的构建及目标基因片段的钓取原理和方法详见本章第五节“植物目的基因的分离克隆方法”的相关内容。

5. 3. 通过PCR扩增获得目标DNA片段聚合酶链反应（polymerase chain reaction , PCR ）是一种模拟DNA复制过程的体外DNA 片段扩增技术。 在基因克隆操作中，经常以PCR扩增的产物为直接克隆的对象。比如，在已知基因序列（或部分序列）的情况下，可以设计特异性PCR 引物，通过PCR技术将目标DNA片段从基因组DNA 或是cDNA中直接扩增出来。 另外，基于PCR技术的逆转录PCR ( RT 一PCR ）是一种较为常用的克隆目标DNA序列方法。

6. 二、载体的选择及制备 • 构建基因组文库，选择克隆能力强的载体，比如黏粒载体、人工染色体载体等； • 小片段DNA克隆，通用型载体，pUC 、pGEM和 pBS等； • 制备DNA 序列分析载体，选用能提供单链DNA的M13载体； • 基因表达，表达型载体，原核表达载体pET系列、植物表达载体pCAMBIA系列等。

7. 载体DNA分离和纯化是基因工程中最基本的技术。质粒载体DNA的制备包括3 个步骤， • 细菌的培养和质粒DNA的扩增； • 细菌的收集和裂解； • 质粒DNA的提取和纯化。

8. 载体的制备 根据裂解细菌方法的不同，质粒DNA 的制备方法可分为去垢剂法、碱裂解法和煮沸法。根据制备规模的不同，质粒DNA 的制备又可分为 大量制备和小量制备。

9. 质粒DNA 制备的基本原理是，在变性条件下（煮沸或碱处理），大肠杆菌的染色体DNA和质粒DNA分子都会发生解链，但闭环的质粒DNA因为拓扑缠绕而不能彼此完全分开；当条件恢复后（回到室温或中性条件），质粒DNA迅速恢复原有的构型，分配到溶液中，而染色体DNA由于和细胞碎片等物质缠绕在一起而不能复性；通过离心，染色体DNA、细胞碎片和变性蛋白质等会被沉淀下来，而质粒DNA分配在上清液中；最后，通过适当的方法（异丙醇或乙醇沉淀法）将水相中的质粒DNA分离出来制备得到 质粒DNA溶液备用．

10. 三、目的DNA 片段和载体的连接 • 互补黏性末端连接用同一可产生黏性末端的限制性内切酶 切割外源DNA 分子和载体后，在外源DNA 片段和载体片段间就可产生互补的黏性末端。

11. 非互补黏性末端连接这时可以将黏性末端全部转化为平末端，然后再按照平末端的连接策略进行外源DNA片段和载体的连接。非互补黏性末端连接这时可以将黏性末端全部转化为平末端，然后再按照平末端的连接策略进行外源DNA片段和载体的连接。 • 平末端连接虽然平末端DNA 片段之间连接的效率要比黏性末端低得多，但是在高浓度的T4 连接酶 催化下也可以进行有效的连接。末端加尾法是利用了末端转移酶将平末端置换为黏性末端的方法。另外，也可以通过末端加接头（linker ）或衔接头（adaptor ）将平末端转化为黏性末端。

12. 四、重组载体转化宿主细胞 1.重组DNA分子构建好后必须转移到适当的受体细胞中才能得到扩增和表达。 2.将普通的质粒分子导入受体细胞的过程称为转化（transformation )； 3.将具有感染能力的噬菌体DNA 分子导入受体细胞的过程称为转染（transfection ）。 4.经过处理后，处于容易接受外源DNA 状态的细胞被称为感受态细胞（competent cell）。

13. CaCl2法大肠杆菌感受态的制备 以及热激法质粒DNA转化 技术具有简单快捷、重复性好等许多优点。 其基本原理为：将处于对数生长期细菌置于0℃ 的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca 2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离，诱导形成感受态（细菌）细胞。加入外源DNA后， Ca 2+又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。经短暂的热激处理（42 ℃ ）后，细菌细胞膜的液晶结构发生改变，并出现许多的间隙，致使通透性增加，部分外源DNA分子便可顺利进入细胞内。

14. 五、重组克隆的筛选 ----鉴别含有目标DNA 分子的克隆 1.表型筛选法：根据表型上的差异，从而筛选得到重组克隆。 2.酶切鉴定筛选法：通过对质粒DNA的酶切分析进行直接鉴定。 3.PCR筛选法：通过PCR对选择培养的单菌落进行鉴定分析。 4.分子杂交筛选法：鉴定重组体克隆中是否含有目的基因。

15. 第五节 植物目的基因的分离克隆方法 分离和克隆目的基因是植物基因工程的首要任务。比如，在植物抗早基因工程中，我们首先必须分离克隆到与抗旱性状高度相关的一些目的基因，然后才能通过基因工程的手段对目标植物的抗早性状进行改良．

16. 利用DNA 芯片分离克隆目的基因：根据基因序列中特异的片段设计探针，制备成代表该生物所有基因的DNA芯片；将不同条件下该生物所有标记的mRNA与DNA芯片 杂交，通过对杂交位点及杂交信号的强弱分析便可获得在特定条件下该生物各基因的表达信息；进而分析这些基因的生理功能并分离克隆到与该生理功能相关的特定基因。 利用生物芯片技术分离克隆基因

17. 利用cDNA微点阵分离克隆目的基因: 将特定组织的全部mRNA反转录为cDNA并与载体连接后构建成cDNA文库，通过PCR对文库进行扩增，得到cDNA微阵列；将特定探针与cDNA微阵列杂交，分析该生物不同条件下的基因表达差异，从而获得对应基因的cDNA克隆，进而分离克隆到特定的目的基因。

18. 利用基因文库的筛选分离克隆基因 基因文库（gene library）：用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA的所有片段随机地连接在载体上，然后转移到适当的宿主细胞中通过细胞增殖而构成各个片段的克隆。当制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就称为某种生物的基因文库。

19. 基因组文库的构建 基因文库的构建就是利用所谓的“鸟抢法”，使基因组的DNA片段随机地插入适当的载体中，引入细胞进行大量繁殖而构建的。

20. 基因组 DNA文库 基因组 DNA文库 基因组 DNA文库 eukaryotes eukaryotes eukaryotes 纯化基因组DNA 基因组DNA的片断化 物理切割和限制性内切酶 纯化基因组DNA 基因组DNA的片断化 物理切割和限制性内切酶 纯化基因组DNA 基因组DNA的片断化 物理切割和限制性内切酶 prokaryotes prokaryotes prokaryotes 与载体连接 与载体连接 与载体连接

21. 根据基因类型不同，基因文库可分为基因组文库和cDNA文库两种．其主要区别在于，一方面，cDNA文库中只包含特定组织或特定条件下表达的基因．而基因组文库中包含的基因与基因的表达与否没有关系，理论上包含了全部基因的信息；根据基因类型不同，基因文库可分为基因组文库和cDNA文库两种．其主要区别在于，一方面，cDNA文库中只包含特定组织或特定条件下表达的基因．而基因组文库中包含的基因与基因的表达与否没有关系，理论上包含了全部基因的信息； 另一方面，cDNA文库中DNA序列不包含植物基因的内含子区及基因的上下游调控区，而基因组文库中包含了基因组DNA上的全部编码区和非编码区序列。 对于植物而言，基因组文库又可分为核基因组文库、叶绿体基因组文库及线粒体基因组文库。

22. 1 ．核酸杂交法 • 核酸杂交法是筛选克隆文库的主要方法，可以依据与目的基因同源的DNA或蛋白质序列合成探针。在适当的条件下，两条同源性很高的DNA单链可以通过碱基互补而发生紧密结合（杂交），可以将某种已知的DNA序列制备成探针（probe )，再通过探针和文库的菌落原位杂交就可以筛选出含有特定DNA序列的克隆。在获得阳性克隆后，还需要进行亚克隆和进一步的杂交分析才能最终分离克隆到植物目的基因。 基因文库中筛选分离目的基因的方法：

23. 2 ．免疫学检测法利用免疫学检测法筛选基因文库时，所用的探针为抗体探针，只适用于对表达文库的筛选，而且只能筛选出表达了的克隆． • 3 . PCR 筛选法PCR 筛选法具有高灵敏度和非放射性等优点。在筛选克隆文库时，采用“反应池”策略。

24. 蛋白质组学 蛋白质组学（proteomics ）可被广泛定义为对生物样本中全部蛋白质系统分析的科学。 蛋白质组（proteome ）是指在一种细胞内存在的全部蛋白质，即基因组表达产生的总蛋白质统称蛋白质组，功能蛋白质组是指那些可能涉及到特定生理生化功能的蛋白质群体。 蛋白质组学的基本技术主要包括蛋白质双向电泳技术和质谱技术等。

25. 双向凝胶电泳技术 是目前蛋白质组研究的主要技术之一, 双向电泳根据等电点和分子量可一次性分离数千种蛋白质，经染色后蛋白质在PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）上可形成密度不同、分布不均的复杂点图谱。

26. 植物目标蛋白和目的基因的分离 利用蛋白质组学技术分离目的基因的基本路线是，首先，通过对双向电泳系统分离的不同组织（器官）、不同发育时期及不同环境条件下不同蛋白质组图谱的对比分析，可以找到在不同时空差异表达的目标蛋白；然后，以目标蛋白的一级结构（氨基酸序列）为依据合成PCR引物（或寡核苷酸探针），通过对基因文库的筛选进一步分离克隆编码目标蛋白的基因。

27. Differential Display Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction （DDRT-PCR） 应用mRNA差异显示技术分离克隆目的基因

28. 原理：（阅读） 用3 ’- 端锚定引物和反转录酶合成cDNA的第一链； 用3 ’- 端锚定引物和5’- 端10-mer随机引物组成引物对，以反转录第一链为模板进行PCR扩增（DDRT-PCR），在标准的序列胶中电泳2~3小时，可显示出50~100条长度在100~5000bp之间的DNA条带。

29. 基本过程：（阅读） 1. 从一对处于不同发育阶段（或不同基因型）的细胞群体中分离总mRNA，并用3’-端锚定引物作反转录合成第一链cDNA; 2.用5’-端随机引物和3’-端锚定引物组成的引物对，在加入放射性同位素标记的dNTP的条件下，以第一步反转录产物作模板进行PCR扩增。 3.将扩增样品在变性的DNA测序胶中进行电泳分离；

30. 4.将有关的差别表达的DNA条带从测序胶上切割下来回收其DNA片断；4.将有关的差别表达的DNA条带从测序胶上切割下来回收其DNA片断； 5.胶块中的DNA量非常少，不能用于克隆，需进行二次扩增； 6.将克隆的特定的DNA分别同基因组DNA及总mRNA作Southern或Northern杂交，测序； 7.以此目的片断作探针从cDNA文库中或基因组文库中筛选全长的cDNA克隆或基因组克隆。

31. 优点： 1. 可以同时比较多个样品表达的差异； 2. 可以同时检测“上游”及“下游”的基因； 3. 检测灵敏度高，所需样品少，经PCR扩增一些低峰度的mRNA也可以被检测出来； 4. 结合使用了PCR和序列胶电泳分析两项技术，使本方法显得较单方便。 局限性： 1. 假阳性比例高（50%～75%）； 同一长度的条带，含有多种DNA序列；邻近条带回收时，造成人为误差；mRNA3’-端序列保守性高，常用3’-端cDNA作探针。 2. 扩增的差别条带分子长度比较短小（110～450bp）；

32. 插入失活技术 所谓插入失活技术是指通过特定的方式将某一DNA 序列随机插入到植物基因组中，当插入序列位于某一基因的对应位点时就会导致该基因的正常功能受阻（失活），在个体水平上表现出突变性状。这样，我们就可以利用插入片段的序列信息，通过RT-PCR 等技术进一步分离克隆到与该突变性状相关的目的基因。

33. 插入失活筛选法

34. T-DNA 标签法 农杆菌介导法是植物遗传转化的主要方法之一，基本原理是根癌农杆菌的Ti质粒上有一段T-DNA可以随机稳定整合到受体植物的基因组中，并稳定遗传表达．当外源报告基因插入到T-DNA 中后对植物细胞进行遗传转化，可以筛选获得大量的转基因群体，并从转基因群体中筛选获得突变体．因为插入序列是巳知的，所以可以从突变体的基因组中分离克隆到目的基因。

35. 转座子标签法 在自然界中有一些质粒或噬菌体中包含有可转移的遗传成分（transposable genetic element ) ，即所谓的转座子（transposon ) ，它最早是由美国冷泉港实验室著名的植物育种学家McClintock ( 1948 ）首先在玉米中发现的，1983年获得Nobel奖。

36. 转座子标签法是指以利用转座子的转移创造植物的突变体，再通过转座子特异探针对突变体基因文库进行杂交筛选，进而分离克隆到植物目的基因的方法。转座子标签法是指以利用转座子的转移创造植物的突变体，再通过转座子特异探针对突变体基因文库进行杂交筛选，进而分离克隆到植物目的基因的方法。 其基本方法是：（阅读）首先，用带有转座子的隐性纯合植物材料与所要分离的显性基因纯系亲本进行杂交，并通过遗传学的鉴定，筛选因转座子插人而表现为隐性性状的突变品系；然后，以所用转座子为探针，对突变品系进行杂交分析，并通过标准的分子克隆技术（如构建基因文库）分离目的基因片段；最后，以该基因片段为探针，从正常的显性基因纯系亲本中克隆出相应的目的基因。

37. 图位克隆法 1 ．确定与目标基因连锁的DNA标记利用RFLP 、RAPD 或AFLP 技术，从分离鉴定大量的DNA 标记群体入手，当标记经鉴定与植物表型有关时，它下游的目的基因就可以被定位在连锁图上。 2 ．构建高密度的遗传图谱在确证DNA 标记与目标基因紧密连锁后，就需构建高密度的遗传图谱，在构建遗传图谱之前，需要弄清遗传图谱中DNA 标记之间以及与目的基因之间的准确位置，随后才可进行染色体步行和基因的克隆。

38. 3 ．构建高密度的物理图谱物理图谱可以根据遗传图谱中彼此之间的物理性连接，确定两个DNA marker 是否明显连锁，如果连锁，再确定遗传距离的大小。 4 ．用YAC 进行染色体步行主要用于确定与一个克隆DNA的起始位点毗邻的基因组克隆。利用第一个标记了末端的克隆为探针，从文库中探测与起始位点相邻的基因组克隆，一旦在一端确定了相邻基因，那么这个新的克隆就被标记，并用来从文库中寻找下一个相邻的克隆，如此反复，逼近目的基因。

39. 依据序列同源性克隆基因 生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列。此方法的基本作法是在其它种属的 同源基因被克隆的前提下, 构建cDNA文库或基因组文库, 然后以已知的基因序列为探针来筛选目的克隆。

40. PCR扩增克隆方法 这是一种参考已知基因的序列克隆基因的方法。目前已经知道了很多植物基因的序列,当克隆类似基因时可先从Gene bank库中找到有关基因序列,用PCR方法克隆不同植物的基因。 基本方法是根据已知基因的序列设计并合成一对引物,从植物中提取DNA进行PCR扩增,扩增的片段纯化后连接到合适的载体上,用酶切分析和序列分析检测重组子,并与已知基因序列进行比较。

42. 电子克隆 • 是建立在物种基因组测序和信息生物学技术基础上的一种基因快速克隆方法。 • 电子克隆技术是生物学数据库中EST数据库、核酸序列数据库、基因组数据库，采用同源性序列比对和归类分析、重叠区域组装和拼接等方法延长EST序列，直至没有与之同源的序列可供拼接为止，所得到的序列可以认为是相对应基因的全长cDNA，根据所得的cDNA序列设计囊括开放阅读框两端的引物，进行RT-PCR克隆出相应基因的方法。

43. 传统的克隆方法是利用基因特异性引物大量扩增cDNA末端或构建cDNA文库并采用原位杂交进行筛选，实验进程长、步骤繁琐、成本高、得率低；传统的克隆方法是利用基因特异性引物大量扩增cDNA末端或构建cDNA文库并采用原位杂交进行筛选，实验进程长、步骤繁琐、成本高、得率低； • 运用电子克隆的方法延伸得到的cDNA几乎囊括了所有疑似为目的基因的cDNA序列，无论表达转录如何调控，都能通过PCR扩增出表达的那一段基因 • 传统的方法如同小规模地捕捞一条或几条鱼，电子克隆与之相比就如同集约化地捕捞一群鱼

44. 相近的物种在核酸序列上有相似性，相近物种中的同源基因序列在一定程度上可以代表目的基因的序列。相近的物种在核酸序列上有相似性，相近物种中的同源基因序列在一定程度上可以代表目的基因的序列。 • 可代表程度与两序列的相似度直接相关，加之遗传密码的简并性，这种混同在理论上是可行的 ，但需要作同源性检验以克服主观因素的影响。

45. 电子克隆的应用 • 电子克隆主要应用于两个方面： • 一个是利用EST序列检索同源性序列，并由此拼接cDNA序列以期挖掘新基因 • 另一方面是在全基因组已经测序的物种 中，研究整个基因组序列以推测其中可能尚未发现的基因。 • 目前应用比较广泛的是第一方面。

46. 关于考试： 避开考试周 植物生物技术导论，百分制，答卷，出勤 植物生物技术实验，百分制，答卷，实验报告 教务处精品课网站：（校级精品课） 参考书目， 实验报告， 实验作业， 课件等（包括授课部分和实验部分，定期更新） Thanks