Наноробот коригира дефект в еритроцитната мембрана

2. Наноробот коригира дефект в еритроцитната мембрана

3. НанохирургияПроф. д-р Никола Колев, дмнМедицински университет ВарнаКатедра Обща и оперативна хирургия

4. Клетки • Микроскоп • Светлина • Атоми • Клетъчна структура • Електромагничтна радиация • Атомни модели • Транспорт на флуиди • Калций медиирани сигнали • Клетъчни микроинжекции • Карбонови нанотръбички • Карбонови нанопипети • IP3, NAADP, cADPr

5. Нанохирургия – използване на наносонди за въвеждане на вещества в една клетка и изследване на отговора ѝ.

6. Courtesy of DOE: www.nano.gov/html/facts/The_scale_of_things.html

7. Клетките са градивните елементи на живота • Най-малката жива единица, която извършва функции характерни за живота • Метаболизъм • Транспорт на вещества • Възпроизвеждане/ растеж - митоза Всички живи същества са изградени от клетки 10-100 трилиона клетки в тялото на възрастен човек Повече от 20000 различни клетки с различни функции За да се наблюдават е необходим микроскоп, а да за се манипулира с клетки са неоходими инструменти от наноскалата

8. Значението на клетките Много различни типове клетки в човешкото тяло За да се разбере как функционират клетките е необходимо да се знае как организма функционира “Клетъчната нанохирургия”е начиндасеизследватотделниклетъчнисреди и механизма на възстановяване / замяна / промянана вътреклетъчниорганели. “Бяла” и червени кръвни клетки Стволова клетка Костни клетки Неврон

9. Защо Нанохирургия върху клетки? Много от болестите могат да бъдат излекувани единствено на клетъчно ниво

10. Защо Нанохирургия върху клетки? • Наномедицина – повлияване на субклетъчно ниво – органели и процеси Например:Генна терапия – една обучена клетка може да контролира хиляди антиракови клетки

11. Конвенционална хирургия Конвенционалната хирургия е физикална интервенция да открие процеса и/или проблема и да се премахне, замени или модифицира част от тялото.

12. Сфера на Конвенционална хирургия Разрез Въвеждане на медикаменти Хирургия в макроскопската сфера Мониториране Манипулации

13. Sizing-Down Хирургия Откриване проблема и да се премахване, замяна или модифициране компоненти. 3m 60μm Клетки Ядро, Органели Белтъци, Клетъчен склет, ДНК 1 μm 1 nm 100 μm 10 μm 100 nm 10 nm Хирургия може да бъде извършена върху клетки чрез инструменти от наноскалата.

14. Области на развитие на клетъчната нанохирургия Разрязване Въвеждане на вещества Клетъчна нанохирургия Мониториране Манипулиране

15. Принципи на визуализация Визуализиране на клетъчни органели 1) Оптични микроскопи • Инструменти проектирани да създават посредством магнитни вълни образ. • Показва детайли видими за човешкото око или камера. 2) Флуоросцентни микроскопи • Използване на светлина визуализираща флуоресциращи молекули за отдиференциране от нефлуоресциращи материали. Визуализиране на клетъчни процеси

16. Примери за флуоресцентно изобразяване на органели

17. Развитие на оптичните микроскопи

18. Съвремени оптични микроскопи Инвертиран

19. Начини за въвеждане на вещества в клетка • Разнообразни техники • Вирусни • Невирусни • Химична ендоцитоза • Фагоцитоза на частици • Инжектиране на флуиди • Въвеждане на флуиди • През наноканали • Минимално инвазивно за клетки • Минимално увреждане на клетките

20. Защо въвеждаме вещества в клетките? 1) Трайно изменяне или промяна на клетъчното поведение – диференциация на стволови клетки. Например: Модифициране на клетка да продуцира и експресира зелен флуоресциращ белтък (GFP) Идеята на това е да накараме клетката да произвежда определени субстанции Клетката произвежда GFP Ядрото произвежда RNA-GFP Въвеждане DNA-GFP Plasmid

21. ? ? Защо въвеждаме вещества в клетките? 2) Изследване на клетъчни отговор на стимули Например: Определяне дали клетката освобождават калции при среща с определена молекула Идеята да оценим отговора на клетката след стимул Органелите освобождават Са2+ Молекулата въздейства върху органели Въвеждане на молекула

22. Въвеждане на микроскопски материали в клетки Клетки от орален карцином (~15 um диаметър) инжектирани с флуоресциращи протеини Протеините не могат да бъдат различени с светлина от видимия спектър, за това се използва флуоресценция

23. Инвертиран микроскоп Манипулатор (Eppendorf) Флуоросцентни снимки(340/380) Клетки от рак на гърдата (SKBR3) инжектирани с Fura-2AM Ex: 340, 380 nm Em: 540 nm Базови Perfusion System Филтър (Sutter) Ex Em Освобождаващи Инжекционна система (Eppendorf) CCD камера (Roper) Съвременна нанооперационна зала

24. Нанохирург на бъдещето

25. Ca2+ IP3 ER Ly IP3-ИндуцираноCa+2освобождаване при клетки на карцином на гърдата – нанотехнология за определяне на терапевтичната чувствителност при карцином на гърдата IP3 – inositoltriphosphate Таргетна клетка Преди инжектиране След инжектиране Traces = average 6 cells +/- s.e.m

26. cADPr ER Ly Ca2+ cADPr- Индуцирано Ca+2освобождаване при клетки на карцином на гърдата cADPr - cyclic adenosine diphosphate ribose • Калций освобождаван отcADPr когато киселите калциеви складове са изчерпани. • Не се освобождава калций когатоRyрецептор е блокиран. • Заключение ER е чувствителен на cADPr през Ryрецептор. Traces = average 6 cells +/- s.e.m

27. Анатомия на клетка = Мембранни органели

28. Цитоскелет • Функции: • Мобилност на клетката и здравина • Транспорт • Състои се от: • Микротубули (в жълто, 25nm) • Микрофиламенти(синьо, 8nm) • Интермедиентни филаменти (10nm)

29. Ядро Склад на генетичната информация (ДНК) Транспортира вещества през пори Епителна клетка

30. Ендоплазмен ретикул(ER) • Функция: • Протеинов синтез, компресиране и транспорт • Калциева сигнализация • Комплакс от лабиринти от тубули • Рибозоми – протеинов синтез

31. Други органели Апарат на Golgi – пакетира и транспортира вещества от ER до специфични части на клетката. Участва в създаването на Лизозомите Лизозоми – Вътреклетъчно смилане, калциева сигнализация.

32. Вътреклетъчна калциева сигнализация – може да бъде таргет на нанохирургията поради комплексната роля в организацията на клетката Вътреклетъчния Ca+2регулира процесите чрез активиране или инхибиране сигнално канали или протеини • Дългосрочни • Генна експресия • Клетъчен цикъл • Растеж • Делене • Апоптоза • Краткосрочен • Секреция • Съкращение • Предаване на сигнал в синапси • Метаболизъм Вторичниете сигнални молекули пренасят сигнали през мембраната за освобождаване на складирания вътреклетъчен калции.

33. Защо е важно изучаването на вторичните сигнални молекули и калциевата сигнализация Нерегулираното освобождаване на калций се асоциира с карцином • Някои вторични сигнални молекули: • IP3 – Inositoltriphosphate • cADPr – Cyclic adenosine diphosphate ribose • NAADP – Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate • Складове за калций: • Ендоплазмен ретикулум(ER) – чувствителен към IP3 and cADPr • Лизозоми(Ly) – чувствителни на NAADP**

34. Клетките са сложни Клетките са пертъпкани среди приютяващи разнообразни органели и скелетни структури разпределени във воден разтвор съдържащ соли и органични материи.

35. Въвеждането на “неща” в клетките е предизвикателство Extracellular Intracellular • Вътреклетъчната среда е различна от извънклетъчната • Клетките са издръжливи, но и много крехки – чувствителни на увреда на мембранатаи промени на йония баланс • Чужди тела могат да отключат възпалителен процес • Клетките са пренаселени пространства – органелите лесно могат да се увредят или разрушат 4mM K+ 150mM K+ 20mM Na+ 145mM Na+ 110mM Cl- 4mM Cl- 0.1μM Ca++ 2mM Ca++ • Цели при въвеждане на вещества в клетка • Да не сеубие клетката в началото • Да не се увреди клетката, така че да не може да се възстанови • Да не се променя неблагоприятно клетката  нежелано повишаване на вътреклетъчния калций • Контролирано доставяне на вещества на клетката • Безопастно и ефикасно

36. Методи за въвеждане на вещества в клетка • Вирусна трансфекция • Невирусна трансфекция: Липозоми Фагоцитоза на наночасти Електропорация Фототрансфекция (лазерна аблация) Въвеждане на наночастици в клетка чрез сонда Инжектиране на разтвори

37. Вирусна трансфекция (инфектиране) Използване на вируси за модифиране на клетки чрез въвеждане на ДНК Introduce virus 1) 4) 2) 3) Cells Virus Infected cells Plate of cells

38. Вирусна трансфекция (инфектиране) Това е публикация нашумяла в медийте за пациент починал след лечение с вирусна трансфекция поради труден контрол на страничните ефекти

39. Невирусна трансфекция – има повече предимства • Физическа транфекция– въвеждане на молекула, медикамент, протеин и др. директно в клетката чрез физичен метод. • Видове невирусна трансфекция • Вещества във везикул • Вещества прикрепени към повърхност • Вещества въвеждани директно чрез сонда • Предимства • Елиминира опасенията за безопасност • Разнообразие от техники от които може да избирате при конкретните условия • Може да се използва за големи групи от клетки или отделни клетки • Недостатъци • По-малко ефективна от вирусна трансфекция • Нужда от специална апаратура

40. Невирусна трансфекция • Липозоми • Опаковано вещество в двуслойна липозома • Капсулата прави контакт с клетъчнаа мембран • Освобождаване на съдържимото • Заредените кополимери • ДНК свързана с полимерна частица • Частица свързана с клетката • Клетка носеща частица (ендоцитоза) • Клетъчна популация, Технически невзискателна трансфекция • Невъзможност за контрол на концентрацията и мястото на въвеждане

41. Невирусна трансфекция Магнетизъм • Фагоцитоза • Твърди материали влизат в контакт с клетка (гравитация, центруфугиране, магнит) • Клетката приема материалите • Клетъчна полулация, Технически невзискателна трансфекция • Невъзможност за контрол на концентрацията и мястото на въвеждане, Частици остават в клетката

42. Невирусна трансфекция “Изстрелване” Магнитно придвижване Видими дефекти на клетъчната мембрана Видими дефекти на клетъчната мембрана • Клетъчна полулация, Технически невзискателна трансфекция • Невъзможност за контрол на концентрацията и мястото на въвеждане, Частици остават в клетката

43. Невирусна трансфекция Въвеждане чрез изстрелване Генен пистолет • Клетъчна полулация, Технически невзискателна трансфекция • Невъзможност за контрол на концентрацията и мястото на въвеждане, Частици остават в клетката

44. Невирусна трансфекция за отделна клетка Прави мембраната пропусклива за екстрацелуларни молекули Електропорация на отделна клетка • Клетъчна популация или отделна клетка • Невъзможност за контрол на концентрацията, полу-сложна трасфекционна постановка

45. Невирусна трансфекция за отделна клетка Фотопорация (лазерна аблация) Прогаря дупка в мембраната и позволява дифузия вещества По-широка пипета с ДНК разтвор Laser • Определена клетка, отличен контрол на позициониране, елиминира физични сонди • Невъзможност за контрол на концентрацията, технически трудна трансфекция, дифузия на екстрацелуларни вещества в клетката

46. Невирусна трансфекция за отделна клетка Иглоподобни наносонди – наносондите днес са толкова тънки, че преминават през канали на клетъчната мембрабна и не е необходимо нейното перфориране • Определена отделна клетка, отличен контрол на позициониране • Ограничен контрол на концентрацията, технически трудна трансфекция, труно производство на сондата,

47. Наноскалпел с прикачен към него клетъчен органел

48. EXTRACELLULAR INTRACELLULAR Цилиндричен наноканал Fluid inside Cell Membrane Наноканал свързан с по-широка сонда Невирусна трансфекция за отделна клетка Микроинжекции на разтвор – най-често използвана техника за прилагане върху отделна клетка трансфекция Submicron Diameter • Определена отделна клетка, отличен контрол на позициониране, бързо контролиращо въвеждане, лесни за производство сонди, • Технически трудна трансфекция

49. Инжектиране на течности Стъклена микропипета – далеч по-дебела от наноинжекцията Submicron Diameter • Предимства • Широкоизползвана, • Платформа за модерна клетъчна физиология • Относително лесна за извършване • Относително ниска цена • Недостатъци : • Само една функция • Чуплива • Голяма за нанохирургия • Инвазивна • Може да причини непоправими увреди на клетъчната мембрана

50. Микроинжекция през наноканали EXTRACELLULAR INTRACELLULAR Cylindrical Nanochannel Fluid inside Cell Membrane Nanochannel connected to larger probe P1 P2 D Flow Pinjection L Flow P1 > P2