Sandro Rusconi (9.3.52)

1. UNIFR Rusconi 2006 Winterthur 01.06.2006 28. W'thurer Fortbildunkgskurs Sandro Rusconi (9.3.52) 1972 -75 Primarschullehrer (Locarno, Switzerland) 1975 -79 Diploma in Molekularbiologie UNI Zuerich 1979 - 82 PhD curriculum UNI Zuerich, molecular biology 1982 - 84 Oberassistent UNI Zuerich 1984 - 86 Postdoc UCSF, K Yamamoto, (San Francisco) 1987 - 93 Group leader, UNI Zuerich, PD 1994 - oggiOrdentliche professor Biochemie UNI Fribourg 1996 - 02 Direktor Swiss National Research Program 37 'Somatic Gene Therapy' 2002 - 03Sabbatical, Tufts Med. School Boston and Univ. Milano, Pharmacology Department 2002 - 05 Präsident Union of Swiss Societies for Experimental Biology (USGEB) 2002 - 06Euregenethy Network (EU-harmonsiation of biosafety and ethical aspects in gene therapy) Sportdoping mittels Gentransfer: relistisch oder nur virtuell? 2005 -... Direktor Divisione Cultura e Studi Universitari Cantone Ticino a a a a a a

2. UNIFR Rusconi 2006 Aspekte die behandelt werden Ziele und methoden der Therapie mittels Gentransfer ('Gentherapie') Gene, Prinzipien, Vektoren, Methoden Wo stehen wir mit Gentherapie? Erfolge und Misserfolge einer 15-jährigen Geschichte Quintessenz Lesen sie vor allem im diesen orange Box Wieso ist Gentransfer attraktiv für den Doping? Erwartungen insbezug auf Leistung und Tarnung Welche konkrete Möglichkeiten gäbe es fuer Gendoping? Praktische Perspektiven, Hürde, Detektionsmöglichkeiten, Nebeneffekte, Risiko-Nutzen Bilanz Schlussfolgerungen Gendoping ist noch im sehr unreifem Zustand, trotzdem bewegt sich jemand in dieser Richtung a a a a a a

3. UNIFR Rusconi 2006 Abschnitt 1: Konzepte Gewebe, Zellen, Genen Genfunktion, Genmanipulation Was ist eigentlich einen Gen? Was man sich vorstellt und was realisierbar ist mit Dentransfer a a a a a a

4. 2 mm 0.2mm 2m 0.02mm 0.001mm DNA RNA Protein UNIFR Rusconi 2006 1 Organismus -> 1013 Zellen (10'000'000'000'000!!!), in spezialisierten Gewebe und Organe • Ergo • in 1 cm3 -> 1'000'000'000 Zellen • um Gentransfer zu erzielen muss man neue DNA Molekuele in den Zellkerne dieser Zellen einschleusen a a a a a a

5. DNA RNA(s) Protein(s) Transcription / translation GENE 2-5 FUNCTIONS Gene expression UNIFR Rusconi 2006 Das Motto: 'ein Gen = eine Funktion' ist definitiv veraltet Ergo: die Nebeneffekte eines Gentransfers koennten viel weiter gehen als man sich von den bekannten Funktionen sich vorstellen darf a a a a a a

6. DNA RNA Protein GENE Transcription / translation FUNCTION RNA DNA UNIFR Rusconi 2006 Aber, was ist eigentlich ein Gen?: ein Segment von Erbinformation die durch eine Nanomachine interpretiert wird • Um die Rolle zu leisten, muss einen DNA Segment folgende Signale beinhalten • RNA Transkription (qualitativ und quantitativ) • RNA Maturatuion • RNA Translation (Uebersetzung in eiweisse) • RNA Abbau Dilemma: wie kann man alles in einem verkuerzten DNA Stück einpacken? spacer regulatory coding spacer a a a a a a

7. UNIFR Rusconi 2006 Was man sich vorstellt und was ist eigentlich machbar im Bereich humaner Gentransfer? gesellschaftliches Mythos der Gentechnik Genmanipulationen werden die Schaffung von gezielt konstruierte transgene Monster-Armeen erlauben Ergo das gilt auch für Gendoping. Fuer die Nächste 30-50 Jahren müssen wir keine transgene Athleten erwarten. Aber somatisch veränderte Sportler sind wohl im Bereich des Machbares. Realität Die Schaffung transgene Menschen (mit erbbaren, artifiziellen Genveränderungen) steht noch weit Man 'begnügt' sich mit somatischem Gentransfer (nicht permanent und nicht erbbar) a a a a a a

8. UNIFR Rusconi 2006 Abschnitt 2: Somatische Gentherapie (SGT) Definition und Anwendungen Unterschiede zur konventionellen Therapie Wieso 'somatisch'? Anatomische Gentransfer-Wege a a a a a a

9. UNIFR Rusconi 2006 Somatische Gentherapie (SGT): Definitionen und Anwendungen Chronische Behandlung efinition von SGT: 'Gene als Medikamente anwenden': Behandlung von Krankheiten mittels Gentransfer Akute Behandlung Vorbeugende Behandlung NFP37 somatic gene therapy www.unifr.ch/nfp37 Erbkrankheiten Erworbene Krankheiten Loss-of-function Gain-of-function a a a a a a

10. UNIFR Rusconi 2006 Pharmakologische Betrachtungen des DNA Transfers Konventionelle Medikamente Protein Medikamente DNA als Medikament • Mw 20 ’000- 100 ’000 Da • Biologically prepared • Slower diffusion/action • Oral delivery not possible • Cellular delivery: - act extracellularly • Can be delivered as soluble moleculesnm size • rapidly reversible treatment • Mw 50- 500 Daltons • Synthetically prepared • Rapid diffusion/action • Oral delivery possible • Cellular delivery: - act at cell surface- permeate cell membrane- imported through channels • Can be delivered as soluble moleculesÅngstrom/nm size • rapidly reversible treatment • Mw N x 1’000’000 Da • Biologically prepared • Slow diffusion • Oral delivery inconceivable • Cellular delivery:- no membrane translocation - no nuclear translocation- no biological import • Must be delivered as complex carrier particles50-200 nm size • slowly or not reversible O H O H O O O H O H O O O H O H • Therapie mittels DNA • braucht spezielle formulierung des Materials (Vektoren) • ist viel komplizierter als konventionelle verabreichung • ist viel weniger reversibel als konventionelle pharmakologische Therapie O a a a a a a

11. UNIFR Rusconi2003 UNIFR Rusconi 2006 Wieso 'somatisch ' ? • Ergo: • somatische Gentherapie berürht die Keimzellen NICHT • Die Veränderung ist nicht erbbar • Keimzellen: die Zellen die für die Vermehrung des Organismus notwendig sind • Solmatische Zellen: alle andere Zellen des Körpers a a a a a a

12. V UNIFR Rusconi 2006 Die drei anatomische Hauptwege fuer den Gentransfer: Ex-vivo In-vivo lokale Verabreichung In-vivo systemische Verab. • Ergo • die ex-vivo und die lokale in-vivo Routen sind heute bevorzugt Beispiele: - Knochenmark - LeberZellen - HautZellen Beispiele: - Gehirn - Muskeln - Auge - Gelenke - Tumoren Beispiele: - Intravenös - intra-arteriell - intra-peritoneal a a a a a a

13. UNIFR Rusconi 2006 Abschnitt 3: Vektoren für Gentransfer Die zwei Klassen: viral und nicht-viral Beispiele der Unterschiede Mini-liste der gängigen Vektoren Limitierungen der gängigen Vektoren a a a a a a

14. A B UNIFR Rusconi 2006 Zwei Klassen von SGT Vektoren: Viral bzw Nicht-Viral non viral gene transfer (transfection) • Wieso sind Viren bessere Vektoren? • viel effizienter! • nicht virakle systeme haben folgende Hürde noch nicht überschritten:- Stabilität im Blut- Spezifisches Andocken- Vermeidung des intrazellulären Abbau- Transfer im Zellkern- Integration ins Wirtsgenom- Anti-apoptotische Funktionen- Tarnung gegenüber dem Immunsystem- ... Nuclear envelope barrier! viral gene transfer (Infection) direct nuclear shuttling! a a a a a a

15. UNIFR Rusconi 2006 Praktisches Beispiel: Transfer eines Reporter-Gens mit Transfektion (= nicht viral) oder Infektion (= Viral) Transfection Zellen inkubiert mit 1'000'000 r-DNA/cell während 12 Stunden Infection Zellen inkubiert mit 3 r-virus/cell während 30 min • Ergo • Gentransfer mit viralen vektoren ist millionenfach effizienter als nicht viraler Gentransfer a a a a a a

16. UNIFR Rusconi 2006 Mini-liste der gängigen Vektoren für Gentransfer Naked DNA Liposomes & Co. Oligonucleotides RNAi r-Adenovirus r- Adeno-associated V. r- Retrovirus r- Lentivirus • Ergo • aber erinnern wir daran: "nobody is perfect..." a a a a a a

17. UNIFR Rusconi 2006 Limitierungen der gängigen SGT Vektoren r-Adenovirus - no persistence - limited packaging - toxizität immunogenizität Biolistic bombardment or local direct injection - limited area r-AAV - no integration in host g. - very limited packaging - autoimmunität? Electroporation - limited organ access Liposomes, gene correction & Co. - rather inefficient transfer r-Retrovirus (incl. HIV) - limited packaging - zufälliger Insertion - unstable genome In generale - ineffizienter transfer - Seltene integration ins Wirtsgenom In generale - Immunantwort - limitierte Verpackungsraum - Stillegung der Expression - Ineffizienz der Produktion • Ergo • in die Zukunft werden synthetische Partikeln viele Virale Funktionen integrieren Solutions: - improved liposomes with viral properties (“Virosomes”) Solutions: - synthetic viruses (“Virosomes”) a a a a a a

18. UNIFR Rusconi 2006 Abschnitt 4: der langsame Fortschritt der Gentherapie Klinische Versuche der letzten 15 Jahren Erfolge und Meilensteine Dokumentierte Nebeneffekte a a a a a a

19. trials patients 100 1500 cancer 80 II 1000 60 I-II I hered. 40 500 vasc. 20 Infect. 1990 1992 1994 1996 1998 2000 UNIFR Rusconi 2006 15 jahre Gentherapie in der Klinik • Ergo • Trotz intensiver Forschung hat weniger als 2% der SGT Versuche Phase III erreicht Januar 2006:1030 cumulative protocols 5300 treated /enrolled patients 66% phase I 19% phase I-II 13% phase II 0.8% phase II-III 1.7% phase III Ausnahmen (China!) Jan. 1. 2004:Gendicine, by Sibiono Inc. 2004, in Cina. 2600 behandelte patienten in 2004, >50'000 in 2005? Nov. 1. 2005:H101, by Shanghai Sunway biotech, in Cina. Unbekannte Angaben. 20% overall still pending or not yet Initiated ! www.wiley.com/genetherapy a a a a a a

20. Isner, 1998 Anderson, 1990 Fischer, 2000 2002 Kirn, 2000, 2001 2002 2003 Manuel Grez Hans Peter Hossle Reinhard Seger 2004/2005 Intravascular adenoviral agents in cancer patients: Lessons from clinical trials (review) dropped in 2004? licensed China 2005? very encouraging data from just initiated clinical trial, prospected >10 patients Bordignon, 2000 (ESGT, Stockholm)2002, science 296, 2410 ff) SibionoShenzen Gendicine (approved China 2004) -> ! Hum Gene Ther 16, 1016 ff. H101 (approved in China, 2005) UNIFR Rusconi 2006 Einige Meilensteine (auch wenn meistens nur in Phase I) 1990, 1993, 2000, // ADA deficiency F Anderson, M Blaese 90/93/ C Bordignon 2000/2004 1997, 2000, Critical limb ischemia J Isner, I Baumgartner, 1998 25 Leben klar gerettet dank Gentherapie ~200 Leben Qualitätsverbessert ~nnn Leben gerettet oder verbessert in China mit Gendicine oder H101 ? 2000, Hemophilia M Kay, K High 2000, 2002, X-SCID A Fischer, 2000/2002, Thrasher 2003 2001, 2003 ONYX oncolytic Viruses D Kirn (Cancer Gene Ther 9, p 979-86) 2004, Chronic Granulomatous Disease M Grez Frankfurt; R Seger Zürich 2004/2005 Gendicine (adeno-p53 vector) L Peng, Sibiono Inc, Shenzen, China a a a a a a

21. UNIFR Rusconi 2005 Die meist befürchtete Nebeneffekte der SGT • Immunantwort zum Vektor • Immunantwort gegenüber dem Frenden Gen • allgemeine Toxizität der viralen Vektoren • Verunreinigungen in den viralen Vektor-Präparate • zufälliger Integratikon ins Wirtsgenoms, -> erhötes Tumor-Risiko • Verunreingung des Genoms von Keimzellen • Ergo • Die Illusion der 90er Jahren ist verdunstet • ZUstand der technologie ist noch unreif • Indikation beschchränkt sich auf tödliche oder sonst schwere Krankheiten a a a a a a

22. UNIFR Rusconi 2006 Beispiele von Nebeneffekte 1:Von Pennsylvania bis Paris NY May 5, 1995, R. Crystal: adenovirus, cystic fibrosis (lung) one patient mild pneumonia-like condition Trial interrupted and many others on hold. UPenn, Sept. 19, 1999, J. Wilson: adenovirus , OTC deficiency (liver) one patient (Jesse Gelsinger) died of a severe septic shock. Many trials were put on hold for several months (years). Paris, Oct 2, 2002, A Fischer: retrovirus , x-SCID (bone marrow) one patient developed a leukemia-like condition. Trial suspended and some trials in US and Germany on hold until 2003. Paris, Jan 14, 2003, A Fischer: retrovirus X-SCID (bone marrow) same cohort a second patient developed a similar leukemia 30 trials in USA were temporarily suspended Ergo SGT kann unter dem heutigen Technologischen Zustand Schwere Nebeneffekte verursachen Paris, Jan 24, 2005, A Fischer: retrovirus X-SCID (bone marrow) same cohort a third patient developed a similar leukemia a a a a a a

23. UNIFR Rusconi 2005 Beispiele von Nebeneffekte 2: Autoimmunität gegen EPO in experimentelle Affen Blood (2004), Vol. 103, No. 9, comment: pp. 3248-3249 Autoimmunity in EPO gene transfer (macaques) Els Verhoeyen and François-Loïc Cosset Papers: - Chenuaud and colleagues (page 3303) - Gao and colleagues (page 3300) inadvertent autoimmune response in nonhuman primates resulting from transfer of a gene encoding a self-antigen. - homologous EPO cDNA via AAV vectors- muscle or lung,- supra-physiologic serum levels of EPO • Ergo • Genexpression in den 'Falschen' Geweben führt zu detektierbaren Unterschiede in der Protein Faltung/Modifizierung • Die Unterschiede können Autoimmunität auslösen • Ein wichtiger Signal fuer alle die träumen sich mit EPO Gentransfer in den Muskeln zu dopen. K High, ASGT June meeting 2004 [Abstract1002] Immune Responses to AAV and to Factor IX in a Phase I Study of AAV-Mediated, Liver-Directed Gene Transfer for Hemophilia B a a a a a a

24. UNIFR Rusconi 2006 Abschnitt 5: Potential von Gentransfer für Dopingszwecke Wieso bleibt es attraktiv? Auf welchen Niveaus dürfte es anwendbar sein? Welche Funktionen könnte man modulieren? Beispiel Tierversuche (Lee Sweeney) a a a a a a

25. UNIFR Rusconi 2006 Doping mittels Gentransfer = 'gene doping') : ...wieso bleibt es so faszinierend trotz den SGT Schwierigkeiten Gentherapie (Zusammenfassung) - Behandlung ist nicht erbbar - Anwendbar für jede Krankheitsklasse - Einige Vektoren wurden verbessert - Das prinzip hat in einigen Fällen funktioniert ...aber: - Noch nicht klinisch konsolidiert - Heutige Technologie beinhaltet viele Risiken - Pionierzustand Dann: was macht Gentransfer so attraktiv für Doping? - mystisches Glauben in der 'Macht der Gene' - erscheint 'natürlicher' als traditioneller D. - man stellt es sich als 'permanent' vor - man stellt es sich 'besser' als konventioneller D. - man meint es sei 'undetektierbar' Ergo: Obiektiv betrachtet, sollte Gentransfer nur zur Behandlung von schweren Krankheiten beschränkt bleiben. Trotzdem interessiert sich den Doping feld vermehrt fuer Gentransfer-Techniken a a a a a a

26. UNIFR Rusconi 2006 Welche Funktionen kommen in Frage als Gendoping-Ziele? • ex vivo, in hämatopoietische Gewebe:pro-hematopo. (Epo receptor, oxygen transport...) • in vivo lokal (Beispiel Muskeln):metabolische Verstärker, Wachstumsfaktoren, Muskelfasern Modulatoren, Herzmodulatoredn(glucose/oxygen, MGF, IGF-1, anti-myostatin, Epo) • in vivo lokal (beispiel gelenke und Sehne):Entzündungshemmer, Erholungsfaktoren, Reparaturfaktoren(anti-TNF, BMPs, ...) Ergo: Doping mittels Gentransfer hat vielfältige Anwendungsrichtungen • in vivo systemisch:metabolische verstärker, Hormone, anti-Schmerzfaktoren (hormone metabolising enzymes, peptide hormones, proenkephalins, ...) a a a a a a

27. muscle force training: IGF-1: UNIFR Rusconi 2006 Die Tierexperimente von Lee Sweeney (2004) haben viel Staub aufgewirbelt... Transfer IGF-1 Gen (J. App Physiol 96, 1097 ff (2004)) • Das System • IGF-1 -> growth factor for muscles • AAV Vector, intra muscular • Rat model , + or - training Die Resultate muscle force and muscle mass increased beyond levels obtained in training ... Hier sind unsere Fragen - Kann man es auf Menschen extrapolieren? - Kg Muskeln zum transformieren? - Wie kann man genügend Vektor herstellen? - Symmetrie der Effekte? - Wie steht es mit Nebeneffekte? Ergo ok, Dr. Sweeney, das gentransfer hat einige Resultate gebracht, aber... - - + + - - + + a a a a a a

28. UNIFR Rusconi 2006 Abschnitt 6: Gefahre und Limitierungen vom Gendoping Welche spezifische Nebeneffekte darf man sich erwarten? Technische und objektive Limitierungen Entdeckungsmöglichkeiten Vergleich mit konventionellem Doping a a a a a a

29. UNIFR Rusconi 2006 Erwartete Nebeneffekte vom Gendoping Mittel- und Kurzfristig • Autoimmunität • Hyperimmunität • Toxischer Shock sport hunter jones.mov Langfristig • Fibrose • Tumoren • Unzugänglichkeit zu spätere Gentherapie Besonders gefährlich: Rücksichtlosigkeit • Ungeeignete Technik (niederes GCP Niveau) • (ungeeigneter Vektor, geringe Kompetenz der Aerzte) • Ungeeignetes Material (niederes GMP Niveau!) (pathogen oder pyrogen kontaminiert ) • Ungenuegender follow-up a a a a a a

30. UNIFR Rusconi 2006 Weitere Limitierungen vom Gendoping Gentransfer mit viralen Vektoren • wieder-verabreiching blockiert • allgemeine und geno-Toxizität Gentransfer mit nicht-viralen Vektoren • allgemein ineffizient • keine oder geringe Nachhaltung Ergo: Risiken und Hürden scheinen höher als die Nutzen Weitere, Strategie-unabhängige Probleme • Aufwendige und kaum zugängliche Technologie • Langfristige Erhaltung der Genexpression ist schwierig • Geringe Rückgängigkeit • Unsymmetrie der Effekte (bei lokaler Verabreichung) a a a a a a

31. UNIFR Rusconi 2006 Entdeckungsmöglichkeitenvom Gendoping Entdeckungstechnologien • Antibody detection (viral antigens) • r-nucleic acids detection (PCR) • recombinant protein / post-translational modification detection (MALDI-TOF , IEF, ELISA) • Ergo • Fremde Gen-reste darf man nur kurzfristig nach Gentransfer in Koerperflüssigkeiten aufspüren • Fremde Gensequenzen sind aber langfristig in Geweben detektierbar • Abnormale Produkte (inkorrekt prozessierte Eiweisse) koennen entstehen und sind detektierbar • Aenderung einiger Reglemente zur Detektion und Sanktion? Die Schwierigkeiten • Anatomically difficult to detect (if locally administered) -> but leaves permanent genetic marking • Detection of nucleic acids cannot be easily performed in body fluids (except in early phase) -> might require specific tissue biopsy a a a a a a

32. UNIFR Rusconi 2006 Vorteile und Nachteile vomGD im Vergleich zum konventionellen Doping KategorieDrug/proteinGene-based Ergo: die Chancen sind theoretisch ziemlich alle gegen die Gendoping-Option Geschwindigkeit schnelllangsam Aber: das obige braucht gesunder Menschenverstand, eine seltene Eigenschaft im Doping-Feld (siehe Veterinärprodukte oder klinisch ungetestete Produkte auf dem Dopingmarkt) RückgangigkeitschnellLangsam Dosierungeinfachschwierig Komplexitätsniveautiefhoch verbundene Risikenje nachdemhoch Tarnungmöglichschwierig a a a a a a

33. UNIFR Rusconi 2006 Abschnitt 7: Schlussfolgerungen und Perspektiven Kurzantworte an komplexe Fragen Danksagung a a a a a a

34. UNIFR Rusconi 2006 Schlussfolgerungen zum Gendoping:(Plakative Kurzantworte zu FAQ ) Denkt jemanden wirklich daran Gendoping bald anzuwenden? bestimmt! Welche Sportart wird vermutlich 'das erste Fall' schaffen? Pferderennen? Welches Land wird die erste Gendoped Athleten 'anbieten'? ...China? Wird Gendoping effizienter als traditioneller Doping sein? Nein Ist es alles vielleicht nur einen Bluff (Abschreckungsmittel)? vielleicht auch... Wird es Opfern der Gendoping Nebeneffekte geben? Ja, bestimmt Welches Gen wird als erste gewaehlt für GD? Epo, dann IGF-1 Wird Gendoping schwierig zum entdecken bleiben ? Nein Ignoranz, Ehrgeiz, Gier Wieso bleibt GD so attraktiv? a a a a a a

35. UNIFR Rusconi 2006 ... Danke, und hoffen wir, dass der Sport uns noch über lange Zeit Emotionen mit viel Fairplay schenken wird Winterthurer Fortbildung - Dr. D. und A. Kappeler - Dr. P.E. Mullis meine Mitarbeiter an der UNIFR für evenktuelle Fragen: sandro.rusconi@unifr.ch info zur SGT und download dieser Slides Show : www.unifr.ch/nfp37 a a a a a a

36. UNIFR Rusconi2002 a a a a a a