运用 MALDI-TOF MS 方法建立 食管癌患者血清蛋白指纹图谱诊断模型

1. 运用MALDI-TOF MS方法建立 食管癌患者血清蛋白指纹图谱诊断模型 河北医科大学第四医院 科研中心/河北省肿瘤研究所 刘丽华王士杰单保恩 孟君 艾军 田子强张泽峰

2. 研究背景 食管癌是最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内是第六位肿瘤致死病因。约50%食管癌发生在中国，绝大多数为食管鳞状细胞癌。目前，食管癌诊断仍然依赖于胃镜活检，患者依从性差。因此，寻找高效的分子标志物对食管癌的诊治有重要意义。

3. 随着人类基因组计划的提前完成，获得大量不同基因序列的信息，但是执行这些信息所蕴藏的各种复杂生物学功能的却是蛋白质。因此，蛋白质组学的地位被提到了前所未有的高度。随着人类基因组计划的提前完成，获得大量不同基因序列的信息，但是执行这些信息所蕴藏的各种复杂生物学功能的却是蛋白质。因此，蛋白质组学的地位被提到了前所未有的高度。 • 基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）是近年出现的一种新的蛋白质组学研究方法，可用于检测临床各种标本，如血清、尿液、脑脊液等。而且，MALDI更特异性关注分子量1000-10000的小分子多肽的特点更优于传统的技术。 • 本研究利用MALDI-TOF MS技术平台，对食管癌患者及正常对照者血清进行检测，并建立食管癌蛋白质谱诊断模型，探讨其在食管癌诊断中的应用。

4. 材料与方法 • 研究对象 71例食管癌患者血清标本全部来自河北医科大学第四医院胸外科，62例经病理诊断为食管鳞癌，9例腺癌，根据AJCC/UICC食管癌TNM分期标准进行分期，正常对照者38例，为健康体检患者，两组间年龄性别比较无显著性差异（P>0.05）。

5. Cluster Cluster analysis analysis Normal Normal Disease Disease 方法 应用磁珠分选的方法进行血清蛋白标本分离富集，采用德国Bruker Daltonics公司的AutoflexШ型质谱仪进行数据采集，并用ZUCI-蛋白芯片数据分析系统进行高通量数据处理，运用遗传算法结合支持向量机运算建立诊断模型并验证。

6. 结果 Figure 1 Peptide and protein standards by MALDI-TOF MS. • 实验质控结果 采用标准血清进行外标校正，校正平均分子量偏差小于100ppm，数据变异系数为18%。（下图为标准品图谱）。

7. 血清蛋白质荷比峰的筛选 在相对分子质量1000～10000范围内，共检测到138个蛋白质荷比峰。统计学处理后食管癌组与健康对照组间P值小于0.05的峰有79个，小于0.01的峰有71个。P值越小，说明在两组中差异越显著，单个峰分组能力越强。选择这些峰随机组合后应用支持向量机法进行运算，建立诊断模型。

8. 模型1区分食管鳞癌组和健康对照组的差异模型 • （由下表11个质荷比峰组成）

9. Figure 2. Representative spectra and gel views of the selected biomarkers. The serum marker 2210 Da from esophageal squamous cell carcinoma (ESCC 1-3) vs. healthy individuals (C 1-3). 例举2210 Da蛋白峰在食管鳞癌组表达

10. 模型2 区分食管鳞癌的不同病理阶段（stage I-II vs. III-IV ）：由以下8个峰组成 m/z of 4195, 4074, 4268, 2106, 4905, 5965, 2863 and 3953 Da。下图例举4195 Da蛋白峰的表达情况。 Figure 3. Representative spectra and gel views of the selected biomarkers.The serum marker 4195 Da from stage I-II esophageal squamous cell carcinoma (I-II 1-3) vs. stage III-IV esophageal squamous cell carcinoma (III-IV 1-3).

11. 模型3 区分食管癌的不同病理类型（ESCC vs. EA ）：由以下7个峰组成 m/z of 4055 2960, 2953, 5388, 2670, 5906 and 4077 Da。下图例举4055 Da蛋白峰的表达。 Figure 4. Representative spectra and gel views of the selected biomarkers. The serum marker 4 055Da from esophageal squamous cell carcinoma (ESCC 1-3) vs. esophageal adenocarcinoma (EA 1-3).

12. 模型验证 所有的样本随机划分，2/3样本作为训练组，1/3样本作为盲法测试组，并将训练组样本再随机分出1/3进行交叉验证，经软件包运算后计算每个样本的平均预测值，并计算出灵敏度和特异度如下表。 Table 3 The predicted results of patterns distinguishing ESCC from health control (Pattern 1), different pathological types of ESCC (Pattern 2) and ESCC from EA (Pattern 3).

13. 讨论 • 食管癌作为消化系统常见的恶性肿瘤，治疗平均5年生存率一直徘徊在30%左右，而早期食管癌患者及癌前病变患者经胃镜下行粘膜内切除术，5年生存率达95%以上。 • 因此，寻找敏感度好、特异度高的食管癌肿瘤标志物应用于早期诊断，对提高患者生存率有重要意义。

14. MALDI-TOF-MS是当今最先进的蛋白组学技术之一，以这一技术开发的系列液体蛋白质芯片可以非特异性结合被测样本中的各种蛋白质，去除高丰度蛋白，而且其结合面积远大于以往的固体蛋白芯片，克服了传统二维凝胶电泳难以解决的诸多问题，为临床筛查肿瘤标志物提供了理想的平台，在发现疾病相关蛋白和后续蛋白鉴定方面具有光明的前景。MALDI-TOF-MS是当今最先进的蛋白组学技术之一，以这一技术开发的系列液体蛋白质芯片可以非特异性结合被测样本中的各种蛋白质，去除高丰度蛋白，而且其结合面积远大于以往的固体蛋白芯片，克服了传统二维凝胶电泳难以解决的诸多问题，为临床筛查肿瘤标志物提供了理想的平台，在发现疾病相关蛋白和后续蛋白鉴定方面具有光明的前景。

15. 本研究运用MALDI-TOF MS技术检测食管癌组和健康组的血清蛋白表达图谱，经过数据分析后我们选择11个蛋白峰建立诊断模型，其中4个高表达于食管鳞癌组，7个低表达。同样，我们建立了高灵敏度和特异度的不同病理分期和病理类型的差异模型。此种联合检测模式，在提高敏感度的同时，保证了较高的特异度。

16. 应用蛋白质组学后的一个问题是大量数据的收集和处理，本研究选用蛋白芯片数据分析系统进行高通量数据处理，经过大量计算机运算和统计学分析，筛选出最优肿瘤标志物组合，确保了诊断模型的准确性和严谨性，优于以往建模方案。应用蛋白质组学后的一个问题是大量数据的收集和处理，本研究选用蛋白芯片数据分析系统进行高通量数据处理，经过大量计算机运算和统计学分析，筛选出最优肿瘤标志物组合，确保了诊断模型的准确性和严谨性，优于以往建模方案。

17. 总之，本研究应用MALDI-TOF MS方法能够检测食管癌患者血清蛋白指纹图谱并建立高灵敏度和特异度的诊断模型。在以后的研究中将进一步扩大样本量，如果能够鉴定并验证特异性的食管癌血清学标志物将对未来的研究具有深刻意义，对于食管癌高发现场的工作具有巨大推动作用。

18. Tanks for your attention!