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等电聚焦电泳

等电聚焦电泳. 李莉. 1. 1. IEFE 定义. 血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）. 2. IEFE 的特点. 3. IEFE 的基本原理. 4. IEFE 的应用. 讲课内容. 1. 1. IEFE 定义. 血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）. 2. IEFE 的特点. 3. IEFE 的基本原理. 4. IEFE 的应用. 讲课内容. 一、 IEFE 定义. IEFE 一种利用具有 pH 梯度的支持介质分离等电点（ isoelectric point ， pI) 不同的蛋白质的电泳技术。

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等电聚焦电泳

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  1. 等电聚焦电泳 李莉 http://www.shsmu.edu.cn/

  2. 1 1 IEFE定义 血红蛋白的等电聚焦电泳（实验） 2 IEFE的特点 3 IEFE的基本原理 4 IEFE的应用 讲课内容 上海交通大学医学院

  3. 1 1 IEFE定义 血红蛋白的等电聚焦电泳（实验） 2 IEFE的特点 3 IEFE的基本原理 4 IEFE的应用 讲课内容 上海交通大学医学院

  4. 一、IEFE 定义 IEFE一种利用具有pH梯度的支持介质分离等电点（isoelectric point，pI)不同的蛋白质的电泳技术。 Isoelectric focusing (IEF), is a technique for separating different molecules by their electric charge differences 上海交通大学医学院

  5. 等电聚焦(Isoelectric focusing ,IEF)就是在电泳介质中放入载体两性电解质(Carrier ampholyte)，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。 上海交通大学医学院

  6. 1 1 IEFE定义 血红蛋白的等电聚焦电泳（实验） 2 IEFE的特点 3 IEFE的基本原理 4 IEFE的应用 讲课内容 上海交通大学医学院

  7. 二、IEFE的特点 （一）优点 • High Resolution • High Sensitivity • Good Reproduction 上海交通大学医学院

  8. （二）缺点 • 1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋 白质可能发生沉淀。 • 2.样品中的成分必须停留在其pI，不适用 在pI不溶或发生变性的蛋白质。 上海交通大学医学院

  9. 分辨率(resolution)较不连续PAGE更高，特别适合于分离分子量(molecuar weight,MW)相同而电荷(electric charge)不同的生物大分子。 上海交通大学医学院

  10. 1 1 IEFE定义 血红蛋白的等电聚焦电泳（实验） 2 IEFE的特点 3 IEFE的基本原理 4 IEFE的应用 讲课内容 上海交通大学医学院

  11. 三、IEFE的基本原理 上海交通大学医学院

  12. 蛋白质分子在不同pH下的解离状态 NH3+ NH3+ NH2 P P P COOH COO- COO- pH＜pI pH＝pI pH＞ pI 上海交通大学医学院

  13. 在电泳介质中放入载体两性电解质(carrier ampholytes)，当通入直流电时，两性电解质形成一个由正极(anode)到负极(cathode)逐渐增加的pH梯度，正极附近是低pH区，负极附近是高pH区。 上海交通大学医学院

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  15. 蛋白质分子的电聚焦过程 + pI1 pI2 pH=pI pI3 pIn - a b c • 蛋白质分子在负极端 • 蛋白质分子在正极端 • 蛋白质样品中各组分聚焦成区带 + — 上海交通大学医学院

  16. 在这个从正极到负极pH逐渐增加的直流电场中，当蛋白质进入这个环境，不同的蛋白质带上不同性质和数量的电荷，向着一定方向移动，迁移到与其相同的等电点位置上停留下来，即被聚焦于一个狭的区带中 ，得以分离。 the proteins become focused into sharp stationary bands with each protein positioned at a point in the pH gradient corresponding to its pI . 上海交通大学医学院

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  18. 进行IEFE必须具备3个条件： ①有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的pH梯度 ②有一个抗对流的电泳材料，使已经分离的样品不再重新混合 ③电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带 上海交通大学医学院

  19. （一）pH梯度的建立 用多种两性电解质(ampholytes)混合物建立稳定良好的pH梯度 上海交通大学医学院

  20. 1.理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes）应具备的特征： ①分子量要小，以便与被分离大分子物质分离； ②化学性质稳定； ③各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的缓冲能力； ④在pI处具有足够的电导，导电性均匀； ⑤两性电解质载体的数目要足够多； ⑥可溶性好； ⑦对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度，不干扰样品的测定。 上海交通大学医学院

  21. 2.载体两性电解质的合成 本质：一系列脂肪族aliphatic ampholytes多氨基多羧酸同系物和异构体，具有很多既不相同又十分接近相互连接的pI值。 pH范围：pH3~10 加成反应 丙烯酸+多乙烯多胺Ampholine（LKB） 上海交通大学医学院

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  24. 3.pH梯度的形成 载体两性电解质(Carrier ampholytes)是一系列不同分子的两性电解质的混合物,在通电后，它们各自迁移到适当位置形成一个连续的pH梯度(pH gradient)。 上海交通大学医学院

  25. pH梯度形成的过程 上海交通大学医学院

  26. ㈠没通电时的变化 所有的载体两性电解质(Carrier ampholytes)分子都荷电，只是溶液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电荷(net charge)为零。 上海交通大学医学院

  27. ㈡引入电场时的变化 载体两性电解质(carrier ampholytes)分子将向阴极(cathode)或阳极(anode)迁移，带有最低等电点的分子（荷最多的负电）将最快地向阳极迁移。当它达到净电荷是零的位置时才停止。 其次一些低pI的载体两性电解质分子（荷其次多的负电）也将向阳极移动，直到它的净电荷被减少到零才停止。 上海交通大学医学院

  28. ㈢电泳结束后的变化 所有的载体两性电解质(carrier ampholytes)分子以增加pI级数的办法将分别在阳、阴极之间到达它们自己的位置而给出一个pI梯度。 上海交通大学医学院

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  30. 电解槽中，通电后，正负两极都会发生电 极反应： 正极端反应：6H2O→O2+4H3O++4e- 负极端反应：4H2O+4e-→2H2+4OH- 在负极引起pH值的升高，在正极pH下降，另外在电极槽的正极端放的是酸性溶液，负极端放的是碱性溶液造成了在电极附近pH的急剧变化。（图a） 上海交通大学医学院

  31. pH - + a 上海交通大学医学院

  32. 由于载体两性电解质(carrier ampholytes)是一系列不同分子的两性电解质的混合物所组成的，设其中某一成分为A，它的pI=pH’，当环境中的pH>pH’时，它带负电荷，朝正极移动。(图b) 上海交通大学医学院

  33. pH A- pH=pH’ - + b 上海交通大学医学院

  34. 当环境pH<pH’时，它带正电荷，朝负极移动，直至移动到它的等电点处，在那里聚集。由于两性电解质A在它的pI处具有一定的缓冲能力，因此在它附近形成一个pH稳定区域。（图c） 上海交通大学医学院

  35. pH pH=pH’ A+ - + c 上海交通大学医学院

  36. 同样载体两性电解质(carrier ampholytes)中各种两性电解质也会各自迁移到它们的等电点(isoelectric point,pI)处，由于它们的数量足够多，各自的等电点相差很小，从而形成一个pH梯度。（图d） 上海交通大学医学院

  37. 假设在一个系统中含有极多的有适当的等电点(isoelectric point,pI)和它的等电点处有一定的缓冲能力的两性电解质(ampholytes)，因此形成的pH梯度将是连续平滑的。 上海交通大学医学院

  38. pH - + d 上海交通大学医学院

  39. pH梯度的选择 在测定未知蛋白时，可先采用broad range的载体，经初步测定后改用narrow range的以提高分辨率。 上海交通大学医学院

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  42. （二）支持介质(medium)的选择 • 作用：防止扩散 抗对流 • 1.liquid medium：蔗糖、Ficoll • 2.gel medium：agarose，sephadex、PAG 上海交通大学医学院

  43. （三）聚焦后的检测方法 • 各种染色法 • 扫描与定量 • 其它检测方法 上海交通大学医学院

  44. 1 1 IEFE定义 血红蛋白的等电聚焦电泳（实验） 2 IEFE的特点 3 IEFE的基本原理 4 IEFE的应用 讲课内容 上海交通大学医学院

  45. 四、Applications of IEF 1.分析分离制备蛋白质、多肽 ①区分人血清蛋白 ②测出异常免疫球蛋白 ③基因分型 ④csf中寡克隆区带的检测 2.测定pI可鉴定蛋白质、多肽 3.双相电泳中，IEF作为第一相 上海交通大学医学院

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  48. 1 1 IEFE定义 血红蛋白的等电聚焦电泳（实验） 2 IEFE的特点 3 IEFE的基本原理 4 IEFE的应用 讲课内容 上海交通大学医学院

  49. 实验 血红蛋白的等电聚焦电泳 上海交通大学医学院

  50. [原理] Hb具有四条多肽链和球蛋白（α、β、γ、δ） pIHbA α2β2 >95% 6.87HbA2 α2δ2 2-3% 7.38HbF α2γ2 <2% 6.98HbA3 <6.87 上海交通大学医学院

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