1 / 28

Костров Сергей Викторович 196-85-01 196-18-53 kostrov@img.ras.ru

Костров Сергей Викторович 196-85-01 196-18-53 kostrov@img.ras.ru. СТРАННОСТИ ГЕНОМОВ. Нематода элегантная. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ГЕНОМИКА ПРОТЕОМИКА БЕЛКОВЫЕ СЕТИ. СВИНОЙ ИНГИБИТОР РНКазы. Бактериальная хромосома. 4 млн н.п. Генетический вектор.

ozzie
Download Presentation

Костров Сергей Викторович 196-85-01 196-18-53 kostrov@img.ras.ru

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Костров Сергей Викторович 196-85-01 196-18-53 kostrov@img.ras.ru

  2. СТРАННОСТИ ГЕНОМОВ Нематода элегантная

  3. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ГЕНОМИКА ПРОТЕОМИКА БЕЛКОВЫЕ СЕТИ

  4. СВИНОЙ ИНГИБИТОР РНКазы

  5. Бактериальная хромосома. 4 млн н.п. Генетический вектор ПРИНЦИП КОНСТРУИРОВАНИЯ ГЕНОМНОЙ БИБЛИОТЕКИ SHOT-GUN (ДРОБОВИК) Расщепление хромосомы на фрагменты Лигирование ГЕНЕТИЧЕСКАЯ БИБЛИОТЕКА Трансформация компетентных клеток Расщепление вектора КЛОНЫ

  6. Начало 80-х годов. Появление технологии рекомбинантных ДНК 1973 г. Герберт Бойер, Стенли Коэн. США. Первая генетическая библиотека E.coli. К этому моменту Обнаружены онкогены мышей Показано, что SV40 способен вызывать злокачественные опухоли мышей. 1971г. Пол Берг начинает работы по исследованию SV40 методами генетической инженерии. 1975 – Асиломарская конференция 1976-1979 Мораторий на использование технологии рекомбинантных ДНК в оркологических исследованиях

  7. ВОЗНИКАЮЩИЕ ПРОБЛЕМЫ • Надо иметь соответствующий генетический вектор. • Надо уметь выделять хромосому, не повреждая ее. • Надо уметь специфически разрезать молекулы ДНК. • Надо уметь зашивать разрезанные молекулы. • Надо уметь вводить молекулы ДНК в клетки.

  8. Вектора для генетического клонирования в клетках прокариот • Плазмидные вектора • Вектора на основе фага  • Вектора на основе фага М13 • Космиды • Фазмиды • Искусственные хромосомы

  9. Плазмидные вектора для клонирования. Плазмида – кольцевая молекула двухцепочечной ДНК, способная к автономной репликации. Природные плазмиды F – факторы (половые факторы) 20-30 тнп пили R – факторы Факторы лекарственной устойчивости

  10. Ori Область начала репликации Плазмидные вектора для клонирования. «Блочная» организация плазмид МаркерAbr Виртуальный эксперимент Введение плазмиды в клетки E.coli (трансформация). Клеток в эксперименте 2х108 Эффективность 104 - 105 трансформации Ожидаемое соотношение: плазмида в 1 клоне из 10 000 Ap Tc Str Cm Em Km Наличие маркера позволяет отделить клоны содержащие плазмиду от клонов исходного штамма при выращивании на селективной среде. Штамм – Ab-

  11. ЯВЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ РЕСТРИКЦИИ ФАГ 102 1012 E.coli K E.Coli B Система рестрикции - модификации 102 r+m+ r-m- r-m+ r+m- Рестриктаза = ограничаза

  12. Apr R Ori Куда будем клонировать? полилинкер Что плохо?

  13. Ori Ap Ap+Tc Проблема селекции. Конструкции с двумя маркерами Apr Tcr pBR322

  14. Ori Вектора прямого отбора -галактозидаза X-Gal Y-Gal Apr LacZ Полилинкер Хозяин должен быть LacZ-.

  15. Apr Ori Другие возможности для прямой селекции Sm Sms Smr SmSd pNO полилинкер Штамм E.coli SmRr

  16. Apr Apr Ori Ori Что получается SmSd E.coli SmRr Ap Sm Ap+Sm

  17. Важнейшее свойство генетического вектора – это его «емкость». Емкость среднего плазмидного вектора около 5000 н.п. Для создания представительной библиотеки геном надо перекрыть не менее 3 раз. СЛЕДОВАТЕЛЬНО

  18. Вектора на основе фага  ДНК ФАГА 45000 н.п.

  19. Лизогенный и литический пути развития фага Литический путь Лизис клетки и высвобождение фагового потомства Лизогенный путь Встраивание ДНК фага в геном бактерии и дальнейшее существование в форме профага

  20. Гены лизогенного пути Cos L Cos R Плечо Плечо полилинкер Фрагмент чужеродной ДНК 15-24 тнп Конструирование вектора замещения ПРЕИМУЩЕСТВА Протяженные вставки Удобное введение в клетки Амплификация Можно ли еще лучше?

  21. Гены лизогенного пути Cos L Cos R Плечо Плечо Развитие фага  Схема катящегося кольца

  22. Схема разматывающегося рулона

  23. Cos L Cos R Нарезание и упаковка фаговой ДНК Cos-сайты конкатемер A Nu1 45000 нп

  24. Cos pl Cos Abr Ori pl Apr R PL Космидные вектора Космиды – плазмидные вектора, в которые встроен участок генома фага  (Cos-сайт), обеспечивающий упаковку этой молекулы ДНК в фаговую частицу. 3000 нп Ori Фрагмент ДНК 40 тнп упаковка 45 тнп ПреимуществаПротяженные вставки Эффективная трансформация

  25. Ori Cos Apr pMYF131 33 000 нп не пакуется PL Ori  Гены литического пути фага  ФАЗМИДНЫЕ ВЕКТОРА Фазмиды – вектора, способные после встраивания чужеродной ДНК существовать и как фаг, и как плазмида. E.coli Репрессор C1ts Фрагмент ДНК 12 тнп Что плохо ?

  26. Ori Cos Apr LacZ PL Ori  Гены литического пути фага  Сайты loxP фага Р1. 34 нп -Blue-Star phagemide, Novagen, UK. E.coli Фрагмент ДНК 12 тнп Репрессор C1ts Cre-рекомбиназа 38кD

  27. Реципиент Trp-,Ura-, Ade- Искусственные хромосомы Tel Tel Ars 100 000 нп pYAC – yeast artificial chromosome Trp1 Ars Ura3 Ori E.coli Sup4ochre (ade2-1) 11 000 нп Apr Вставка 90 000 нп UAG - амбер UAA - охра UGA - опал Tel Tel

More Related