第六讲 固定化酶技术

1. 第六讲固定化酶技术

2. 酶催化具有效率高、专一性强、速度快等优点。酶催化具有效率高、专一性强、速度快等优点。 • 但是，酶是蛋白质，分离纯化过程复杂、稳定性差，不能反复使用，价格较昂贵。 • 目前，酶主要在医药、食品及高附加值化工产品上广泛应用，其它领域则相对较少。 • 为扩大酶的应用范围并降低成本，有效的途径是实现酶的多次使用或直接使用细胞；固定化酶技术就是在这种思路下发展起来的。

3. 自上世纪60年代初就有人研究过固定化酶，最初是以色列人以木炭、骨髓等吸附酶，自上世纪60年代初就有人研究过固定化酶，最初是以色列人以木炭、骨髓等吸附酶， • 然后是日本的千佃一郎领导的制药公司，首先将氨基酰化酶固定于葡聚糖凝胶中，用于拆分DL-氨基酸； • 接着召开了两次固定化酶的国际酶工程年会。

5. 至今已经有许多种固定化酶获得大规模的工业应用，例如固定化青霉素酰化酶生产-6-氨基青霉烷酸（6-APA）。至今已经有许多种固定化酶获得大规模的工业应用，例如固定化青霉素酰化酶生产-6-氨基青霉烷酸（6-APA）。

6. 葡萄糖异构酶生产高果糖浆

7. 上世纪70年代出现固定化细胞技术。利用固定化大肠杆菌生产L-天冬氨酸上世纪70年代出现固定化细胞技术。利用固定化大肠杆菌生产L-天冬氨酸

8. 一、制备固定化酶的基本策略 • ⒈固定酶时，必须尽量保证其活性部位的氨基酸残基不发生变化； • ⒉避免导致酶蛋白高级结构破坏的操作（如高温、强酸，强碱等）； • ⒊尽量在温和条件下、使酶被其底物或抑制剂饱和或抑制下进行。

9. 二、固定化酶的优缺点 • ⒈优点 • 容易与底物或产物分离，降低分离成本；可以在较长时间内、反复分批或连续反应；稳定性较好；反应受严格控制；可组合进行多酶反应。 • ⒉缺点 • 固定化时活力损失较大；传质阻力增加，反应速率下降；只能用于溶解性底物和小分子。

10. 三、酶的固定化方法 • 固定化酶的方法可分为下列三大类 载体结合法 交联法 包埋法

11. 1. 载体结合法 • 该法将酶与水不溶性载体结合形成固定化酶 • 根据结合的形式不同，可分为： • ⑴物理吸附法 • ⑵离子结合法 • ⑶共价结合法

13. ⑴物理吸附法 • 使酶与载体通过物理吸附形成结合。 • 可供选择的载体很多；无机载体有活性炭、多孔玻璃、酸性白土、氧化铝、硅胶、羟基磷灰石、金属氧化物等； • 天然高分子载体有淀粉、多糖、谷蛋白等； • 人工合成载体有大孔径吸附树脂、人工陶瓷、疏水载体等。

14. 吸附法利用载体表面分子内聚力不均匀的特点吸附酶，该法不破坏酶的活性中心和高级结构。因此，固定的酶活力回收高；吸附法利用载体表面分子内聚力不均匀的特点吸附酶，该法不破坏酶的活性中心和高级结构。因此，固定的酶活力回收高； • 载体与酶的结合力是物理吸附，结合力弱，酶易脱落，半衰期短。

15. ⑵离子结合法 • 通过形成离子键固定化酶 • 载体有多糖类离子交换剂（DEAE-纤维素、 DEAE-葡聚糖、CM纤维素）；合成高分子离子交换树脂，例如Amberlite IRA-系列。

16. 特点；操作简单，处理条件温和，高级结构不被破坏，能得到酶活力收率较高的固定化酶；缺点和吸附法相似，受电解质浓度影响极大。特点；操作简单，处理条件温和，高级结构不被破坏，能得到酶活力收率较高的固定化酶；缺点和吸附法相似，受电解质浓度影响极大。 • 已有工业化成功实例 • DEAE纤维素及DEAE葡聚糖固定化氨基酸酰化酶用于拆分DL外消旋氨基酸。

17. ⑶共价结合法 • 利用酶与载体形成共价键固定酶 • 此法载体与酶结合牢固、半衰期长。 • 形成共价键的反应剧烈，常常引起酶蛋白高级结构发生变化，因此酶活力回收一般较低。

18. 共价结合法使用的载体主要有： • 纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳素及其衍生物、氨基酸共聚物、甲基丙烯酸（或醇）共聚物、多孔玻璃等。

19. 酶蛋白中，可用于共价固定酶的功能基有氨基（Lys-ε-NH2和N-末端α-氨基）；羧基（Asp、Glu、 C-末端α-羧基）；酪氨酸的酚羟基；半胱氨酸的巯基；羟基（Ser、Thr、Tyr）；His咪唑基；Trp的吲哚基等，其中以氨基和羧基最常用。 • 共价固定酶的主要化学反应有；酰化反应、芳化和烷基化反应、溴化氰反应、重氮化反应以及硅烷化反应等。

20. ①酰化反应 • 酶蛋白上的氨基与含酰化基团，如酰化叠氮、酸酐等的聚合物发生反应。 • 上述反应的pH通常在7.5—8.5之间，反应温度在4℃左右。

23. ②芳化和烷基化反应 • 氨基与含有卤代芳环或卤代杂环的载体作用实现偶联。 • 例如用氯化三嗪活化载体，即将其连接于载体上而活化； • 多糖类可与氯化三嗪连接，例如琼脂，纤维素及葡聚糖等。 • 该反应的速度比酰化反应慢，且要求未质子化的亲核试剂，与反应的pH关系很大。通常在pH8.5～9.0下进行。

24. ③溴化氰反应 • 在碱性条件下（pH10—11.5），溴化氰活化多糖的羟基成环化的亚氨基碳酸盐，然后与酶蛋白中的氨基形成共价键，使酶固定。 • 该类反应通常产生三种不同的结构，即在N位与酶连接的氨基甲酸酯；在N位与酶连接的亚氨基碳酸酯；在N位与酶连接的异脲。

26. 对于纤维素载体等多糖 • 直接在糖环上固定酶可能导致固定和传质阻力大； • 在碱性条件下可接枝一个柔性手臂进行改善； • 与β-硫酸酯乙砜基苯胺(SESA)反应，生成对氨基苯磺酰乙基纤维素（ABSE-纤维素），再重氮化偶联。 • 接枝氨基酸的交联壳聚糖微球与酶反应，接入亲水柔性手臂。

31. ④重氮化反应 • 带有芳香氨基侧链的聚合物用HNO2处理,得到重氮化的芳香族活性载体。 • 在pH8～9时，该载体与酶蛋白上Tyr的酚羟基、His上的咪唑基发生偶联反应，使酶固定。 • 偶联的结果增加了固定化酶的疏水性，不利于在水环境发挥催化作用，但似乎有利于在疏水环境下催化。若要在水环境中催化，可用多糖作偶联剂抵消疏水作用。

33. 除Tyr、His以外，蛋白质N末端上α-氨基和赖氨酸上ε-氨基也能与活化载体偶联，形成双偶氮化合物；此外，Arg胍基，Trp吲哚基也能发生重氮化偶联。除Tyr、His以外，蛋白质N末端上α-氨基和赖氨酸上ε-氨基也能与活化载体偶联，形成双偶氮化合物；此外，Arg胍基，Trp吲哚基也能发生重氮化偶联。

34. ⑤硅烷化反应 • 无机含硅载体，例如多孔玻璃或多孔陶瓷，其来源丰富，价格低廉，机械强度高而又耐有机溶剂，是固定化酶的良好载体。 • 将无机载体与有机硅化合物（包括硅烷偶联剂）作用，实现硅烷基化 • 接下来使烷基活化，最后与酶的氨基反应。

36. (6)活性酯法 • 该方法对于具有游离羧基的载体适用

38. 该方法对于巯基载体适用

39. 2. 交联法 利用双功能基团试剂制备固定化酶的方法。 常用的试剂有戊二醛、碳化二亚胺、重氮联苯胺和马来酸酐共聚物等。 ⑴戊二醛 戊二醛使赖氨酸残基上ε-氨基参与交联。

42. ⑵异氰酸

43. 双重氮联苯胺 -HCl ⑶重氮联苯胺

44. ⑷碳化二亚胺

45. ⑸二环氧化物 • 用两末端都含有环氧基团的化合物,如1,4-丁二醇二缩水甘油醚，二环氧辛烷，与具有亲核性的基团，如羟基、伯氨基或巯基作用（与羟基作用在高pH、氨基在弱碱性）

46. 二乙烯砜 • 二乙烯砜是一种高活性的化学试剂，一般在碱性水溶液中进行反应。反应温度为室温

47. 3.包埋法 • 将酶包裹于凝胶或聚合物半透膜或微胶囊中的方法叫包埋法。该法条件温和，酶不参与反应，活力回收较高。但是，包埋法受限于底物和产物分子体积。 • 用于包埋的试剂多为多糖，如海藻酸盐，K-角叉菜、琼脂、乙基纤维素及聚丙烯酰胺凝胶等。 • 方法有微胶囊、相分离、乳化、脂质体等。 • 值得注意的是聚丙烯酰胺凝胶，其聚合反应如下

48. 控制交联剂及单体用量可以控制其网格大小。 • 此外，还有光诱导聚合固定化酶等方面的技术。

49. 固定化酶的性质 • 活力变化 • 在多数情况下，比活力低于天然酶，少数提高。例如羧甲基纤维素固定的胰蛋白酶活力仅为原酶的30%（水解酪蛋白），这主要是固定化使酶活动空间、底物、产物扩散受限所致。

50. 稳定性 • 大部分酶固定化后稳定性提高，少数下降 • 热稳定性，提高最适温度，一般是10℃以上 • 对有机溶剂的稳定性及酶抑制剂的稳定性提高。 • pH稳定性，明显优于游离酶。一般而言，用带负电荷载体制备的固定化酶，其最适pH值比游离酶高；用带正电荷载体制备的固定化酶，其最适pH值比游离酶低；主要是吸附相反电荷离子的电荷平衡造成的。