Purificación de DNA

1. Purificación de DNA Dra. Esther Z Vega Universidad de Puerto Rico Humacao

2. Resumen • DNA total • DNA de plasmidio • DNA de fagos

3. Aislamiento de DNA de bacteria • Las bacterias se cultivan en medio favorable a temperaturaóptima • Se lisanlascélulasy se libera el contenido • Tratamiento del extractocelularpara remover todos los componentesexcepto el DNA • Se concentra la solución de DNA

4. DNA Purification > Total Cell

5. Crecimiento de la bacteria • Crecimiento de mediolíquido • Mediodefinido • Mediocomplejo • Crecimiento en mediosólido

6. Monitoreo del crecimiento Growth can be monitored by optical density

7. Monitoreo del crecimiento Growth can be monitored by optical density

8. Separación de células • Colecta de células • Centrifugación

9. Monitoreo del crecimiento • Preparación del extractocelular • Las célulasdebenlisarseparaliberar el DNA • MétodosFísicos • Fuerzamecánicaesaplicadapararomper la pared y la membrana • Mortero, sonicación • MétodosQuímicos • Ataquequímico a la pared ymembranacelular • Pared- lisozima, EDTA o ambos • Membrana- detergente (SDS)

10. Lisiscelular

11. Rompimiento de la pared • La lisozimadigiere los polisacáridos, componentesestructurales de la pared • EDTA (tetraacetato de etilenediamina) enlazaiones de magnesioesenciales en preservar la estructura de la célulaeinhibelasenzimasquepuedendegradar el DNA

12. Rompimiento de la membrana • SDS es un detergentequeremuevelasmoléculas de lípidos

13. DNA Purification > Total Cell > Breaking Cell

14. DNA Purification > Total Cell Centrifuge removes insoluble cell debris

15. Purificación del DNA • Además del DNA, todavía se encuentranunagrancantidad de proteínasy de RNA • La remoción de éstasesimportanteparaevitarinterferencia en el análisis

16. Remoción de proteínasy RNA • Extracciónorgánica • Adición de fenolófenol/cloroformo • Se precipitanlasproteínas; formación de unacapablanca en la interfase entre la capaorgánicay la acuosa • Se remueve la soluciónacuosa

17. DNA Purification > Total Cell > Purification Organic Extraction

18. Extracciónorgánica • ¿Quétalsi hay un exceso de proteínas? • Se repitenlasextracciones con fenol • No favorable; destruccióndel DNA con el movimiento • Rompimiento con proteasa antes de la extracción • Pronasaoproteinasa K

19. Extracciónorgánica • Parte del mRNA esremovido con el tratamiento a fenol. • El remanente del RNA puede ser digerido con ribonucleasas (siesnecesario).

20. DNA Purification > Total Cell Concentration of DNA

21. Extracciónpor Silica • Guanidiumthiocyanate • Desnaturaliza el material que no es DNA • Haceque el DNA se enlace a laspartículas de silica • Se añade silica directamenteo la muestra se pasaporunacolumna de silica • Remoción de DNA al añadiragua

22. DNA Purification > Total Cell > Purification Purificación de DNA con partículas de silica

23. Extracción de DNA de otrostipos de células • Célulasvegetales: alto contenido de carbohidratos • Lisozima no tienenefecto • Se añade CTAB (cetylmethylammonium); se une a los ácidosnucléicosy los precipita • Se centrifugay se remueve el sobrenadante • Célulasanimales: no tienen pared, lisan con SDS

24. DNA Purification > Total Cell Purification of Plant DNA

25. DNA de plasmidio • Se crece la bacteria y se colecta • Se rompenlascélulasy se libera el contenido • Se trata el extractocelularpara remover todos los componentesexcepto el DNA de plasmidio • Se concentra la solución de DNA

26. DNA de plasmidio • Separaciónbasada en diferencias entre el plasmidioy el DNA bacterial • tamaño- plasmidios son mucho máspequeños

27. Separaciónportamaño • En orden de maximarlasdiferencias, rompimientomínimo del DNA bacterial • Cuando el rompimientoesmínimo, el DNA formará parte del debris celular • Rompimientomínimo se lograutilizandotécnicas de rompimiento suave

28. Rompimiento suave de la célula • Tratamiento con lisozimay EDTA en presencia de sucrosaevita el rompimientoinmediato • Al formaresferoplastos, la célulapuedelizarse con la adición de detergentes no-íonicos

29. DNA Purification > Plasmid DNA

30. Separación basado en conformación • Separación por el ¨superenrollamiento¨de pequeños plasmidios circulares

31. Separación basada en conformación • Rango de pH másestrechocuando el DNA ¨superenrrollado¨esdesnaturalizadoy el DNA regular no. • Se usa un lisadoclaro • Al añadir base; DNA regular esdesnaturalizado • Al añadirácido; DNA regular esunamasa ¨enredada¨ • El DNA ¨enredado¨es¨pellet¨

32. DNA Purification > Plasmid DNA

33. Separaciónbasado en conformación • DNA ¨superenrrollado¨ tambiénpuede ser separado del DNA regular utilizandobromuro de etidio en asociación con un gradiente de densidad con cloruro de cesio (CsCl)

34. Separaciónbasado en conformación • Bromuro de etidio se enlaza a DNA normal, perosólo en cantidadlimitada a DNA ¨superenrrollado¨ • Este enlazamientocausa un movimiento en la banda de DNA ¨normal¨

35. DNA Purification > Plasmid DNA

36. DNA Purification > Plasmid DNA

37. DNA de fagos • El DNA de fagospuedeestarfuera de la célula; no hay quecomenzar con un extractocelular • Al centrifugar el cultivo, la bacteria estará en el pellet y el fago en suspensión • La dificultadesobtenerunaconcentracióngrande de fagospor ml de cultivo

38. Para obtenertítulos altos • El fagodebeestar en faselítica • Los fagosdebeninfectar la baceria al momentojusto en el ciclo de crecimiento

39. Purificación de DNA fagos • Los fagospueden ser precipitados con glicol de polietileno (PEG) • Centrifugar. Descartar el sobrenadante. Redisolver. • Purificarporgradiente de densidad de CsCl.

40. www.dpo.uab.edu/~jglinvil/JS572web S572,FL06,MPurifyDNA.pdf