Normative e linee guida per la validazione dei metodi di analisi

1. Normative e linee guida per la validazione dei metodi di analisi Giampaolo Tommasi A.C.R.A.F. S.p.A. Angelini Farmaceutici Sviluppo Farmaceutico g.tommasi@angelini.it

2. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Introduzione • Aspetti normativi:linee guida ICH, FDA, Emea • Finalità studi di validazione • Come sviluppare un metodo analitico HPLC:caso pratico • Risultati di una validazione • Convalida analitica e specifiche di prodotto • Approfondimenti: • Stress test - normative • Finalità studi di degradazione • Considerazioni generali sulla degradazione • Fattori che favoriscono la degradazione di un farmaco • Conclusioni

3. VALIDARE = pesare quanto vale VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Perché validare un metodo di analisi Misurare una caratteristica o proprietà di un prodotto Titolo principio attivo Contenuto di impurezze pH di una soluzione (es. collirio) Stabilire quanto è attendibile la misura ottenuta

4. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Normative sulla validazione: FDA The FDA is responsible for protecting the public health by assuring the safety, efficacy, and security of human and veterinary drugs, biological products, medical devices, our nation’s food supply, cosmetics, and products that emit radiation. The FDA is also responsible for advancing the public health by helping to speed innovations that make medicines and foods more effective, safer, and more affordable; and helping the public get the accurate, science-based information they need to use medicines and foods to improve their health.

5. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Normative sulla validazione: FDA • Reviewer Guidance - Validation of Chromatographic Methods • Guidance for Industry - Analytical Procedures and Methods Validation - Chemistry, Manufacturing, and Controls Documentation http://www.fda.gov

6. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Normative sulla validazione: Emea European Medicines Agency (EMEA) is a decentralised body of the European Union with headquarters in London. Its main responsibility is the protection and promotion of public and animal health, through the evaluation and supervision of medicines for human and veterinary use. The EMEA coordinates the evaluation and supervision of medicinal products throughout the European Union. The Agency brings together the scientific resources of the 25 EU Member States in a network of 42 national competent authorities. It cooperates closely with international partners, reinforcing the EU contribution to global harmonisation.

7. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Normative sulla validazione: Emea • CVMP/VICH/590/98-Topic GL1 >> Guidelines on Validation of analytical procedures: Definitions and Terminology • CVMP/VICH/590/98-Topic GL2 >> Guidelines on Validation of analytical procedures: Methodology http://www.emea.eu.int

8. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Normative sulla validazione: ICH The International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) is a unique project that brings together the regulatory authorities of Europe, Japan and the United States and experts from the pharmaceutical industry in the three regions to discuss scientific and technical aspects of product registration. The purpose is to make recommendations on ways to achieve greater harmonisation in the interpretation and application of technical guidelines and requirements for product registration in order to reduce or obviate the need to duplicate the testing carried out during the research and development of new medicines. The objective of such harmonisation is a more economical use of human, animal and material resources, and the elimination of unnecessary delay in the global development and availability of new medicines whilst maintaining safeguards on quality, safety and efficacy, and regulatory obligations to protect public health

9. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Normative sulla validazione: ICH • Q2A >> Text on Validation of Analytical Procedures • Q2B >> Validation of Analytical Procedures: Methodology http://www.ich.org

10. Identificaz. Quantitativa Impurezze - + + - - + + - + + + + - + + - - + + - - - + + - - + - - + + - - + + - VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Linea guida ICH Q2A Test di validazione Precisione Accuratezza Specificità Linearità Intervallo Limite di detection (LOD) Limite di quantificazione Robustezza Test di efficienza del sistema

11. TEST PIANO DI STUDIO REPORT VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico

12. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico PRODOTTO >> Gel a base di Diclofenac sodico SCOPO DELLO STUDIO >> Trasferimento sito produttivo DOCUMENTAZIONE >> Dossier farmaceutico • Attività Produzione di lotti pilota >> secondo quanto indicato nel dossier Transfert method >> test statistico Documenti >> emissione di certificato analitico

13. tR = 20,447 min s = 1.51 (s = a/b) N = 3241 Width = 0,8467 min VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico VALUTAZIONE METODO DI ANALISI Condizioni analitiche Colonna: LiChrospher RP Select B M.Ph. >> 50% MeOH - 50% Tampone fosfato Conc. Diclofenac >> 0.25 mg/ml Vol. inj. >> 20 µl (5µg diclofenac) Flow rate >> 1.7 ml/min pH >> 4.3 circa l >> 282 nm Temperatura >> 40°C

14. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico VALUTAZIONE DEI RISULTATI CROMATOGRAFICI • Lunghi tempi di ritenzione >> analisi lunghe (tR = 20,447 min.) • Simmetria picco non ottimale >> problemi integrazione (s = 1,5) • Bassa efficienza >> rapida usura della colonna (N = 3241) CONCLUSIONI • Picchi con la pancia >> analisi problematica DECISIONE • Rivalidazione metodo di analisi

15. Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico PIANO DI STUDIO >> Informazioni VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Cosa misuriamo >> Analisi quantitativa diclofenac Come misuriamo >> Tecnica Cromatografica Principi chimico - fisici >> RP-HPLC / Legge di Lambert - Beer Campo di applicazione >> Rilascio lotti (SI) >> Studi di stabilità (SI) >> Convalida di processo (SI) >> Cleaning validation (NO)

16. Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico PIANO DI STUDIO >> Informazioni VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Chimica sost.esame >> Impurezze e prodotti di degradazione Metodi noti >> Diclofenac in collirio Forma farmaceutica >> Eccipienti / Gel Preparazione campione >> Solubilità sostanza in esame Tempo analisi >> Obiettivo max 10 minuti

17. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico CHIMICA DICLOFENAC SODICO fonte Farmacopea Europea Prodotto degradazione Fornitore MP

18. Formulato Diclofenac sodico >> 1 g Copherol F 1300 >> 1 g Carbopol 980 >> 1.50 g Ammoniaca Sol 10% >> 2.60 g Cetiol V >> 0.50 g Phospholipon 80 >> 2.00 g Titriplex III >> 0.04 g Eutanol G >> 0.50 g Aroma “Vert de Creme” >> 0.02 g Alcool Isopropilico g >> 20.17g Acqua dem.ta >> q.b. a 100 g Analisi Alto contenuto massa gelificante Alto contenuto massa grassa Phospholipon 80 >> effetto matrice Profumo “Vert de Creme” (mix) Verifiche Doppia diluizione >> riduzione interf. Intervallo tra 0.2 - 0.6 µg >> no sovracarico Analisi placebo Phospholipon 80 Analisi spettrale VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico FORMULATO PRODOTTO fonte Dossier farmaceutico

19. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico • Doppia diluizione: verifiche con vari solventi • Ipotesi: solvente che aprisse la matrice gelificante (senza solubilizzarla) • Obiettivo: estrarre il P.A. senza modificare la sua ionizzazione • Sperimentale: Solventi di estrazione >> • MeOH - ACN - Fase Mobile - Isopropanolo • Prove rispetto al Phospholipon • Ipotesi: possibile “effetto matrice” • Obiettivo: Verificare possibile interferenza con il Phospholipon • Sperimentale: • Campione con Phospholipon >> 102.4% • Campione senza Phospholipon >> 103.7%

20. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico VALUTAZIONE METODI ANALOGHI RIFERIMENTO tR = 7,141 min s = 0.86 (s = a/b) N = 4480 Widh = 0,2511 min Condizioni analitiche Colonna: LiChrosorb RP18 M.Ph. >> 60% MeOH - 40% Tampone fos.to (0.5M) + NaOH 1N Conc. Diclofenac >> 0.20 mg/ml Vol. inj. >> 10 µl (2 µg diclofenac) Flow rate >> 1.0 ml/min pH = alcalino (magg. 7,0) l >> 278 nm Temp. >> 25°C SAMPLE tR = 8.440 min s = 1.37 (s = a/b) N = 1621 Widh = 0,4933 min

21. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico OTTIMIZZAZIONE METODI DI ANALISI Condizioni analitiche Colonna: LiChrospher RP Select B M.Ph. >> 50% ACN - 50% Tampone ac.to + N(Et)3 0.01M Conc. Diclofenac >> 0.08 mg/ml Vol. inj. >> 5 µl (0,4 µg diclofenac) Flow rate >> 1.0 ml/min pH = ( 6,5 circa) l>> 282/(220) nm Temp. >> 28°C SAMPLE in MeOH

22. Dati cromatografici Metodo originale Metodo ottimizzato Tempo ritenzione (tR) 20,447 min. 4,167 min. Simmetria (s) s = 1,51 s = 0,89 Efficienza (N) N = 3241 N = 9618 Base picco 0,8467 min. 0,1 min. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Sviluppo di un metodo di analisi HPLC: caso pratico OTTIMIZZAZIONE METODI DI ANALISI - Valutazioni

23. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico SPECIFICITA’ SCOPO DEL TEST: Misurare la sostanza in esame in presenza di sostanze potenzialmente interferenti TIPOLOGIE TEST Identificazione Il metodo analitico deve identificare selettivamente l’analita Dosaggio Il metodo analitico deve dosare selettivamente l’analita Purezza Il metodo analitico deve interagire selettivamente con l’analita

24. Risposta Concentrazione 100% 100% VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico RANGE E LINEARITA’ NO NO

25. Test validazione Metodo originale Metodo ottimizzato Range 4,0 - 6,0 mg 0,2 - 0,6 mg Coeff. correlazione 0,999 0,999 Pendenza 85537 22944,37 Intercetta 61575 - 5,13 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico RANGE E LINEARITA’

26. Confronto intercette tabulato 2.14 >> sperim. 1.10 Confronto pendenze tabulato 2.14 >> sperim. 1.08 Confronto intercetta retta standard con lo zero tabulato 2.14 >> sperim. 1.15 Confronto intercetta retta ricostituito con lo zero tabulato 2.14 >> sperim. 1.13 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico RANGE E LINEARITA’

27. Errore sistematico del metodo di analisi Errore casuale del metodo di analisi • Test di Efficienza • tR >> tra 4.0 e 4.8 min • s >> tra 0.8 e 1.0 • N >> maggiore 8000 • Rs >> non indicabile • CV% area >> inf. 2.0% VALIDARE = pesare quanto vale VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico ACCURATEZZA, PRECISIONE, TEST EFFICIENZA ACCURATEZZA Recupero >> -0.71% PRECISIONE CV% >> 1.01%

28. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico CONCLUSIONI pH fase mobile Eluizione pH-dipendente % Modificatore organico ACN sostituisce MeOH Temperatura Da 40°C a 28°C

29. ACCURATEZZA Recupero >> -0.71% • Specifiche prodotto • Rilascio lotti >> 95% - 105% • Studi stabilità >> 95% - 105% PRECISIONE CV% >> 1.01% 95% 100% 105% VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Validazione di un metodo di analisi HPLC: caso pratico SPECIFICHE: Prodotto vs. Validazione

30. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Stress Test >> introduzione • Aspetti normativi • Finalità studi di degradazione • Considerazioni generali sulla degradazione • Fattori che favoriscono la degradazione di un farmaco • Temperatura / Umidità • Luce • pH • Agenti ossidanti • Conclusioni

31. Aspetti normativi VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Stress Test come voce di glossario [rif. ICH Q1A] • Stress Test come parte della linea guida [rif. ICH Q1A_2R] • Validazione metodi di analisi “stability indicating” [rif. ICH Q2B] • Qualificazione e quantificazione impurezze [rif. ICH Q3A] • Studi di stabilità principi attivi noti [rif. EMEA CPMP/QWP/122/02]

32. Aspetti normativi alcune considerazioni …. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Numero di lotti da utilizzare nei test di stress >> 1 • Non è necessario identificare e/o quantificare potenziali impurezze • Non è necessario effettuare studi cinetici • I risultati ottenuti possono essere utilizzati come dati di supporto • Ampia libertà nella conduzione dei test

33. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Scopo studi di degradazione • Ottenere informazioni dalla degradazione forzata di un P.A. • Verificare le caratteristiche intrinseche di stabilità di un principio attivo • Mettere in evidenza quali fattori provocano la degradazione del principio attivo • Prevedere accorgimenti necessari nello sviluppo formulativo di un prodotto • Valutare le misure necessarie da adottare al fine di proteggere il prodotto • Sviluppo e convalida della più adatta procedura analitica • Anticipare il comportamento del prodotto finito durante gli studi di stabilità

34. Personale qualificato • Piano sperimentale corretto: VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Cosa occorre? • Conoscenza della chimica organica di degradazione • Conoscenze analitiche della sostanza in esame • Interpretazione dei risultati • Caratteristiche strutturali della molecola in studio • Durata del piano deve avere carattere predittivo • Tipologia dei test per favorirne la degradazione

35. MOLECOLA TEST DURATA VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Degradazione: considerazione generali

36. Degradazione: la molecola • Caratteristiche strutturali • Forma farmaceutica VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Gruppi funzionali vs principali reazioni di degradazione Ampio ventaglio di principi attivi Eccipienti Impurezze presenti in materie prime

37. Degradazione: durata dei test P.A. B C k1 k2 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Aspetti generali • Carattere predittivo • Raggiungere il 10 - 20% di degradazione • Esempio: reazione consecutiva di 1° ordine

38. Degradazione: durata dei test VALIDAZIONE METODI DI ANALISI

39. Degradazione: caratteristiche test VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Aspetti generali • Verificare vari fattori ambientali • Replicare i processi degradativi • Tipologia dei test Stato Liquido: Esposizione Luce Esposizione pH Esposizione agenti ossidanti Stato Solido: Esposizione Temperatura-Umidità Esposizione Luce

40. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Test >> Temperatura - Umidità • Aspetti normativi It should include the effect of temperatures (… 50°C - 60°C)… and humidity (75%RH or greater) where appropriate … • Campioni analitici Principi attivi - Miscele (p.a. + eccipienti) - Formulati Direttamente esposti [rif. Q1A_R2] • Principali processi degradativi Idrolisi - Decarbossilazione - Ossidazione - Pirolisi (?!?) Polimorfismo

41. k2 P.A. B C k1 VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Test >> Temperatura - Umidità • Durata ?? >> piccola considerazione termodinamica • Ea  22 kcal  mol-1 • Eq. Arrhenius k = A e-Ea/RT T = 60°C T = 25°C k(60°C)/k(25°C)  30 60 gg; (T= 60°C)  4,9 aa; (T=25°C)

42. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Test >> Temperatura - Umidità • Alcune considerazioni sulla degradazione in fase solida Formazione interfaccia solido-liquido (soluzioni sovrasature) Principio attivo o eccipienti a basso punto di fusione Eccesso di solventi residui da processi di granulazione Assorbimento di umidità (sostanze igroscopiche) Acqua di idratazione

43. Protocollo di studio VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Esposizione Temperatura - Umidità • Condizioni: • temperatura >> 50° - 60°C • umidità>> 75% - 85% RH • Durata: 60 giorni • Controlli: 0 - 15 - 30 - 45 - 60 giorni

44. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Test >> Luce • Aspetti normativi • Rif. linea guidaQ1A(R): It should include the effects … of photolysis on the active substance. • Rif. linea guida Q1B: condizioni sperimentali • Durata ?? Scopo del test >> forzare la degradazione Tempo almeno doppio delle condizioni del test di conferma

45. Fosforescenza/Fluorescenza • Emissione calore • Dimerizzazione • Prodotti di degradazione • fotolitici • fotossidazione P.A. P.A.* h h VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Test >> Luce • Fotodegradazione • Esempio >> dimerizzazione

46. h h Metoxarato VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Test >> Luce • Esempio >> prodotti di degradazione - fotolisi • Esempio >> prodotti di degradazione - fotossidazione Procedono attraverso un intermedio radicalico (INIZIATORE)

47. Protocollo di studio VALIDAZIONE METODI DI ANALISI • Esposizione luce • Condizioni - Stato solido Stato liquido • Secondo ICH Q1B (forced degradation) • Durata: 3 - 10 giorni 3 giorni • Controlli: 0 - 1 - 3 - (7 - 10) giorni 0 - 1 - 3 giorni

48. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Test >> pH • Aspetti normativi …should also evaluate the suscettibility of active substance to hydrolysis across a wide range of pH values when in solution or suspension … • Campioni analitici Classico schema a tre punti di pH • Principali processi degradativi Idrolisi - degradazioni pH catalizzate

49. VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Test >> pH • Esempio • Processi di degradazione idrolitica che possono essere studiati con uno schema a tre punti di pH

50. Esempio: Hydrochlorothiazide Andamento degradativo che richiede uno schema di studio a più di tre valori di pH VALIDAZIONE METODI DI ANALISI Test >> pH