实验 4 酶切重组质粒 电泳分离所插入的 DNA

1. 实验 4 酶切重组质粒 电泳分离所插入的DNA

2. 目 的 1．鉴定。鉴定所培养的单菌落中是否含有重组质粒，或仅含有自身环化的质粒。当酶切产物电泳后，重组成功者电泳后会出现大小不等的两条DNA条带，一条为线性质粒载体的DNA，分子量大，在后面，另一条为插入的目的基因，分子量小，在前面；而自身环化者仅有一条载体的DNA条带。 2．收获。通过电泳分离，使载体与插入目的基因分开，便于分别回收载体和已大量扩增了的插入目的基因。比如探针用片段。

3. 本实验由2个部分组成： （1）酶切重组质粒； （2）DNA的琼脂糖凝胶电泳。 ● 关于限制性内切酶 本实验选用的限制性内切酶是分子生物学中最为常用的工具酶。通常不同的限制性内切酶分别能识别一小段双链DNA序列，长度多在4～6个核苷酸，且呈双重对称的DNA序列，并将其切断。有粘端和钝端两种形式：

4. EcoR I ↓ 5'...GAATTC...3' → 5'...G AATTC...3' 3'...CTTAAG...5' 3'...CTTAA G...5' Pst I ↓ 5'...CTGCAG...3' → 5'...CTGCA G...3' 3'...GACGTC...5' 3'...G ACGTC...5' Sma I ↓ 5'...CCCGGG...3' → 5'...CCC GGG...3' 3'...GGGCCC...5' 3'...GGG CCC...5'

5. 利用这种特性，可以选择适当的酶来切割所需的DNA片段，或选择适当的酶切开载体，造成载体的粘端序列与插入DNA的粘端序列相同，以便于重组质粒。具体酶的特性、识别位点等可以参考不同公司的试剂目录。利用这种特性，可以选择适当的酶来切割所需的DNA片段，或选择适当的酶切开载体，造成载体的粘端序列与插入DNA的粘端序列相同，以便于重组质粒。具体酶的特性、识别位点等可以参考不同公司的试剂目录。

6. ●琼脂糖凝胶电泳 DNA的琼脂糖凝胶电泳是分子生物学实验中使用广泛的技术，该技术利用DNA分子在电场下向电场一极迁徙的特性。在pH中性的条件下，DNA分子由阴极向阳极迁徙。其间，DNA分子量大，摩擦阻力大，在凝胶的孔隙中迁徙得慢；分子量小，摩擦阻力小，迁徙快，在电泳一定时间后，大小不等得DNA分子可以得到有效得分离。同样分子量的DNA，环状的较线性的迁徙速度快。分离的DNA可以方便地用溴乙锭染色，方法是：（1）在灌胶时直接把溴乙锭混入凝胶，或（2）电泳后将凝胶浸入溴乙锭染液（我们推荐前者），染色后在紫外透射灯下可以看到橘红色的DNA条带，在一般实验室最低分辨能力（肉眼可见的）约为50～100ng。

7. 原 理 采用限制性内切酶Hind III切开插入DNA与质粒载体，将这一反应液上样于琼脂糖凝胶，电泳，使分子量小的插入DNA前移，并与分子量大的在电泳中滞后的质粒载体DNA分开。

8. 实验准备 （参考教材）

9. 实验步骤 1．酶切质粒 取一洁净的1.5ml Eppendorf管，编好号，插入冰中，依次加入： 水 7ul 10×缓冲液2ul BSA 2ul 重组质粒 8ul Hind III1ul 20ul 盖上盖，混匀，将反应物甩入管底，置37℃水浴中温育1小时。

10. 2．灌胶 将粘胶纸粘于灌胶模槽的两端，制成灌胶模。放入梳子。将模放于水平台上。 取一烧杯，放入： 琼脂糖0.7 g 5×TBE 10 ml 水40 ml 50 ml 混匀，加热，至琼脂糖彻底溶解。待稍冷后，加入5ul饱和的溴乙锭，轻晃混匀，然后轻轻倒入模子。用吸头吸去表面小泡。待冷却成胶。 如果梳子大且角锐利，应该离模具底部远些，以防拔梳子时将凝胶底部拔穿。

11. 3．上样电泳 将胶两头粘胶纸揭去，移入电泳槽，梳子一侧靠近操作者，注入1×TBE缓冲液，浸没凝胶，轻轻拔出梳子。接上电源：阳极远离上样孔，阴极靠近上样孔（DNA向阳极移动）。加4ul上样缓冲液入酶切反应液，混匀，插入冰内。加2ul上样缓冲液入10ul小量制备的重组质粒，混匀，插入冰内。上样次序：由右向左。第1孔：5ul标准品梯度DNA，第2孔：12ul未经切割的重组质粒DNA，第3～6孔：24ul含上样缓冲液的酶切反应液。加样时，加样头尖端插入上样孔内1/3高度，轻轻将样品推入，使比重较大的样品自然沉入上样孔底。 避免刺入前后凝胶和刺穿凝胶底部（幻灯）。开启电源，电压调至100V。通常半小时后检查。

13. 实验结果 置凝胶于长波紫外透射仪上，可见清晰的呈淡橘红色的标准品若干梯度条带、一条对应于2000～2500bp的未被切割的环状含插入片段的质粒和分别对应于250bp和3000bp的两条DNA条带。前面一条约250bp的DNA条带即放大了的插入DNA片段，后面一条为线状的质粒DNA。

15. 注意事项 1．若所制备的质粒不能被内切酶切割，可用酚/氯仿抽提一次。 2．如前所述，一些限制性内切酶对乙醇敏感，比如EcoR I。一旦样品有痕量乙醇污染，会引起酶的失活，难以切开DNA。此时，可以将样品试管开盖，置于70℃干浴器中若干分钟，使乙醇逐渐挥发，这样十分有效。

16. 3．常见错误 （1）溶解凝胶时，凝胶沸腾后立即外溢。因此，加热溶解凝胶时操作人员不能离开。 （2）上样的错误：前后左右和底部的凝胶被刺破，样品漏掉或电泳条带的形态不好。尤其是底部刺穿，样品遗失十分可惜。形成原因是没有经验和手法不好。介绍手法。另外，样品温度过高或上样缓冲液含量不够，比重不够，上样时样品漂浮起来，溢出孔外。

17. （3）电极放反。有时电极没有放反，但接入电源时被接反，结果一样，使DNA样品倒迁徙，立即移出凝胶，工作失败。因此，建议电泳前仔细检查，电泳一段时间后，观察染料确实向前移出后，方可离开。（3）电极放反。有时电极没有放反，但接入电源时被接反，结果一样，使DNA样品倒迁徙，立即移出凝胶，工作失败。因此，建议电泳前仔细检查，电泳一段时间后，观察染料确实向前移出后，方可离开。 （4）电泳时间过头。电泳时间通常视分离片段的大小而定，一般为半小时至1小时。如果电泳时间过长，目的DNA可能会迁移出凝胶外，实验失败。因此建议使用定时器或含有定时功能的电泳电源。

18. （5）凝胶自灌胶模具上滑落下来。由于观察电泳结果要将凝胶自灌胶模具推移至紫外透射仪上，且往往紫外透射仪安放在暗室，这样需要将凝胶自电泳槽中移出，搬迁。在此过程中容易发生凝胶自灌胶模具上滑落。避免的方法是以食指抵在灌胶模具槽的一端，槽向食指倾斜，使凝胶靠在食指上，左右由于有槽的两侧侧壁护着，保证凝胶不致滑落。（5）凝胶自灌胶模具上滑落下来。由于观察电泳结果要将凝胶自灌胶模具推移至紫外透射仪上，且往往紫外透射仪安放在暗室，这样需要将凝胶自电泳槽中移出，搬迁。在此过程中容易发生凝胶自灌胶模具上滑落。避免的方法是以食指抵在灌胶模具槽的一端，槽向食指倾斜，使凝胶靠在食指上，左右由于有槽的两侧侧壁护着，保证凝胶不致滑落。 （6）凝胶滑入电泳缓冲液。当紫外透射观察后，如果不同片段的分离尚不彻底，需要进一步电泳时，要将凝胶放回电泳槽。此时，凝胶因脱离过模具，粘附不紧，容易自模具中滑入槽内的电泳缓冲液中。若未及时发现，通电后会造成DNA迁徙出凝胶。因此要求凝胶确保未移动后方可通电继续电泳。

19. （7）凝胶浓度不对。过浓或过稀。介绍手册上的方法：大约小片段（100bp左右）用2%左右凝胶，大片段（500bp以上）用1%左右，可以用到0.8%。（7）凝胶浓度不对。过浓或过稀。介绍手册上的方法：大约小片段（100bp左右）用2%左右凝胶，大片段（500bp以上）用1%左右，可以用到0.8%。 （8）电泳缓冲液比例或内容不对，偶尔也可以见到。 4．电泳后的DNA条带会在凝胶中自行扩散，因此要求电泳后立即观察，以免条带扩散。

20. 实验 5 从凝胶中回收DNA

21. 目 的 从凝胶中回收DNA是分子生物学中经常要做的工作。为此，已发展了许多方法，比如： （1）低熔点凝胶。 （2）透析袋电泳分离。 （3）凝胶挖槽电泳分离。 （4）S&S NA45 DEAE膜DNA分离与回收。该方法回收率高，且具有很高的纯度（教材上有详细介绍）。 （5）用QIAquick Gel Extraction Kits回收凝胶中的DNA。该方法效率高、所回收DNA的纯度高，且能大大缩短了实验的时间，业已形成产品。我们予以介绍。

22. 第一次使用前，在15ml漂洗液PW中加入60ml无水乙醇。第一次使用前，在15ml漂洗液PW中加入60ml无水乙醇。 所有工作均在室温下进行。

23. 操作步骤 1．将目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分），放入干净的离心管中，称取重量。 2．加入3倍体积溶胶液PN（如果凝胶重0.1g，其体积可视为100ul，加入300～500ul溶胶液），50℃水浴放置10分钟。期间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解（若胶块过大，请事先切碎）。 3．试管恢复至室温。 4．加入10ul 3M NaAC，混匀，室温下10分钟。 5．将此溶液加入一个吸附柱，下置收集管，13000rpm离心30秒。倒掉收集管中的废液，将吸附柱再次插上收集管。

25. 6．向吸附柱中加入700ul漂洗液PW，13000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱再次插上收集管。6．向吸附柱中加入700ul漂洗液PW，13000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱再次插上收集管。 7．向吸附柱中加入500ul漂洗液PW，13000rpm离心2分钟。将吸附柱置于室温或50℃温箱中数分钟，彻底晾干（若漂洗液有残留会影响回收效率和质量）。 8．将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20ul 65～70℃预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟。13000rpm离心1分钟收集DNA溶液。 9．为提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回同一离心吸附柱中，重复以上步骤8。

26. Thanks