Predykcja glikanów syntetyzowanych w komórkach poddanych działaniu promieniowania jonizującego

1. Institute of Automation Silesian University of Technology Gliwice, Poland Predykcja glikanów syntetyzowanych w komórkach poddanych działaniu promieniowania jonizującego Roman Jaksik Anna Lalik Andrzej Michalski Joanna Rzeszowska-Wolny

2. Reakcje glikotransferazy Budowa glikanów produkowanych w procesie glikozylacji jest uzależniona od tzw. kodu biosyntetycznego - zestawu różnorodnych biosyntetycznych reakcji katalizowanych przez enzymy – glikotransferazy. Eksperymentalne określenie koncentracji poszczególnych glikanów jest aktualnie niezwykle trudnym zadaniem. 98 genów glikotransferaz (GT) 42 reakcje glikozylacji Ponad 10,000 różnych struktur glikanów Na podstawie informacji o poziomie ekspresji genów GT powinno być możliwe określenie zestawu struktur pojawiających się z największym prawdopodobieństwem. Pojawienie się „osobliwych” glikanów na powierzchni komórki jest wykorzystywane w diagnostyce, gdyż stanowią one znacznik (marker) komórek nowotworowych, ich obecność często świadczy o szybkim rozwoju choroby.

3. Predykcja struktur glikanów Informacje o budowie znanych glikanów Informacje o ekspresji genów glikotransferaz predykcja Zestaw struktur glikanów (Kawano et al. 2005)

4. Predykcja struktur glikanów • Budowa bazy danych Struktury glikanów opisane w bazie danych KEGG Glycan rozbito na pojedyncze pary monosacharydów połączonych określonym wiązaniem ENTRY G00001 Glycan NAME N-Acetyl-D-glucosaminyldiphosphodolichol COMPOSITION (GlcNAc)1 (PP-Dol)1 MASS 203.2 (PP-Dol) REMARK Same as: C04500 REACTION R05969 R05970 PATHWAY ko00510 N-Glycan biosynthesis ko01100 Metabolic pathways ENZYME 2.4.1.141 2.7.8.15 NODE 2 1 PP-Dol 3 0 2 GlcNAc -4 0 EDGE 1 1 2:a1 1 /// Baza danych KEGG Glycan Dla każdej struktury zliczono ilość wystąpień każdej możliwej pary | GlcNAc a1 PP-Dol | GlcNAc b1-4 GlcNAc | Man b1-4 GlcNAc | ... --------+------------------+--------------------+-----------------+---- G00001 | 1 |0|0| G00002 | 1 | 1| 0 | G00003 | 1 | 1| 1 | .... Pomiędzy każdymi dwiema parami monosacharydów obliczono miarę podobieństwa (Cosine) określającą jak często dane dwie pary wiązań występują razem w jednym glikanie Macierz reakcji | GlcNAc a1 PP-Dol | GlcNAc b1-4 GlcNAc | Man b1-4 GlcNAc | ... -------------------+------------------+--------------------+-----------------+---- GlcNAc a1 PP-Dol | 1 | 0.456 | 0.364 | GlcNAc b1-4 GlcNAc | 0.456 | 1 | 0.743 | Man b1-4 GlcNAc | 0.364 | 0.743 | 1 | .... Macierz korelacji

5. Predykcja struktur glikanów Informacje o budowie znanych glikanów Informacje o ekspresji genów glikotransferaz predykcja Zestaw struktur glikanów (Kawano et al. 2005)

6. Predykcja struktur glikanów • Ekspresja genów glikotransferaz (GT) Ekspresje genów GT zmierzono za pomocą 6 mikromacierzy oligonukleotydowych dla komórek nowotworowych poddanych działaniu 4Gy promieniowania jonizującego. K562 K.1 K562 0h.1 K562 K.2 K562 0h.2 K562 24h.1 K562 24h.2 surowe dane ekspresji genów EntrezGeneID | K562 0h.1 | K562 0h.2 | K562 24h.1 | ... -------------+-----------+-----------+------------+--- 2523 | 5.98 | 6.01 | 6.31| 79087 | 5.63| 5.27 |5.35| 2527 | 4.17 | 4.46 | 4.28 | 6482 | 3.63 | 3.60 | 3.60 | .... Dane poddano niestandardowemu przetwarzaniu dzięki któremu określono grupę genów GT których ekspresja zmienia się w sposób znamienny statystycznie na skutek promieniowania. przetworzone dane ekspresyjne | fold change | p-value | EntrezGeneID| K562 0h/C | K562 24h/C | K562 0h/C | K562 24h/C | -------------+------------+------------+-----------+------------+ 2523 | 1.3589 | 1.2610 | 0.0342 | 0.0009 | 10678 | 1.3457 | 1.1593 | 0.0346 | 0.0023 | 56886 | 1.4818 | 1.2026 | 0.0442 | 0.0205 | .... geny GT o zmienionym poziomie ekspresji Na podstawie informacji z literatury określono jakie wiązania katalizowane są przez glikotransferazy będące produktem wybranych genów LFuc a1-3 GlcNAc GlcNAc b1-3 Gal GlcNAc b1-4 Man Gal b1-4 Xyl GlcNAc b1-4 Man .... lista reakcji katalizowanych przez stymulowane geny

7. Predykcja struktur glikanów Informacje o budowie znanych glikanów Informacje o ekspresji genów glikotransferaz predykcja Zestaw struktur glikanów (Kawano et al. 2005)

8. Predykcja struktur glikanów • Współczynnik predykcji LFuc a1-3 GlcNAc GlcNAc b1-3 Gal GlcNAc b1-4 Man Gal b1-4 Xyl GlcNAc b1-4 Man ... … | GlcNAc a1 PP-Dol | GlcNAc b1-4 GlcNAc | ... ------------------+------------------+--------------------+ GlcNAc a1 PP-Dol| 1 | 0.456 | GlcNAcb1-4GlcNAc| 0.456 | 1 | Man b1-4 GlcNAc | 0.364 | 0.743 | ... Dla każdej struktury w oparciu o macierz podobieństwa miedzy parami glikotransferaz obliczany jest współczynnik predykcji

9. Predykcja struktur glikanów • Współczynnik predykcji 1 2 • SC (qi,bj)–współczynnik korelacji pomiedzy wiązaniami katalizowanymi przez glikotransferazeqi oraz element badanej struktury bj • Eg(qi) – poziom ekspresji genu qi • n – liczba genów GT analizowanych za pomocą mikromacierzy • m – liczba wiązań w aktualnie analizowanej strukturze

10. Predykcja struktur glikanów • Zmiany ekspresji genów GT – K562 Expressionlevel GT gene

11. Predykcja struktur glikanów • Weryfikacja metodą leave-one-out Specyficzności algorytmu zweryfikowano metodą leave-one-out tworząc macierz podobieństwa dla wszystkich struktur poza jedną która użyta została jako wzorzec reakcji w miejsce reakcji katalizowanych przez zbiór genów glikotransferaz. procent struktur jakie zostały zidentyfikowane na określonym miejscu 4036 elementów listy predykcyjnej lub ponad nim

12. Wyniki predykcji 1st rank Structure: G04183 Score: 2,404 3 struktury o największym współczynniku predykcji tj. o największym prawdopodobieństwie pojawiania się na powierzchni badanych komórek w wyniku działania promieniowania jonizującego wg. zastosowanej metody 2nd rank Structure: G04804 Score: 2,389 3rd rank Structure: G05226 Score: 2,389

13. Weryfikacja wyników Do charakterystyki glikanów na powierzchni komórki użyto lektyn znakowanych barwnikiem fluoroscencyjnym oraz czytnika mikropłytek mierzącego poziom fluorescencji. • Zmiany na poziomie glikanów określone za pomocą znakowanych lektyn nie odzwierciedlają bezpośrednio zmian na poziomie transkryptów genów glikotransferaz z uwagi na długi czas potrzebny na ich zsyntetyzowanie. transkrypcja glikozylacja transport translacja DNA mRNA Białka (GT) Glikany ~ 24 godziny • Badanie wykonano 24 godziny po poddaniu komórek działaniu promieniowania jonizującego.

14. Podsumowanie W wielu sytuacjach zestaw glikanów może nie odzwierciedlać teraźniejszego bądź przeszłego stanu transkryptomu z powodu skomplikowanych mechanizmów regulacyjnych pojawiających się na wielu etapach procesu powstawania i transportu glikanów. Planowane udoskonalenia metody: • Opracowanie lepszych metod weryfikacji w oparciu o dane uzyskane za pomocą znakowanych lektyn • Możliwość definiowania zestawu aktywnych reakcji na podstawie danych innego typu niż mikomacierzowe (np. real-time PCR) • Uwzględnienie kinetyki reakcji glikozylacji podczas wyznaczania współczynnika predykcji

15. Dziękuje za uwagę

16. Predykcja struktur glikanów • Zmiany ekspresji genów GT

17. Wyniki predykcji