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第九章 氨基酸与核酸发酵 第一节 味精 一、概述 味精俗称 麸酸钠、谷氨酸钠 （分子式 C 5 H 8 NO 4 Na ）

第九章 氨基酸与核酸发酵 第一节 味精 一、概述 味精俗称 麸酸钠、谷氨酸钠 （分子式 C 5 H 8 NO 4 Na ）. （一）生产历史 早期 — 从天然的食物材料中取得 中期 — 最早商业化制造味精的原料是面筋 近期 — 糖是生产味精的主要原料. （二）氨基酸的制备方法 发酵法 ：直接发酵法、添加前体的发酵法 提取法 ：胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸 酶法 ：利用微生物细胞或微生物产生的酶 合成法 ： DL- 蛋氨酸、 DL- 丙氨酸、甘氨酸、和苯丙氨酸。. 万吨. （三）味精的生产. 图 1 ：味精的产量走势.

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第九章 氨基酸与核酸发酵 第一节 味精 一、概述 味精俗称 麸酸钠、谷氨酸钠 （分子式 C 5 H 8 NO 4 Na ）

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  1. 第九章 氨基酸与核酸发酵 第一节 味精 一、概述 味精俗称麸酸钠、谷氨酸钠（分子式C5H8NO4Na）

  2. （一）生产历史 早期—从天然的食物材料中取得 中期—最早商业化制造味精的原料是面筋 近期—糖是生产味精的主要原料

  3. （二）氨基酸的制备方法 • 发酵法：直接发酵法、添加前体的发酵法 • 提取法：胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸 • 酶法：利用微生物细胞或微生物产生的酶 • 合成法：DL-蛋氨酸、DL-丙氨酸、甘氨酸、和苯丙氨酸。

  4. 万吨 （三）味精的生产 图1：味精的产量走势

  5. 二、谷氨酸的生物合成机理 1. 谷氨酸 （-氨基戊二酸） O C-OH 第一代鲜味剂 H2N- C- H L-谷氨酸单钠盐——味精 H-C-H H-C-H H-C O OH L-型

  6. 2.谷氨酸的生物合成 葡萄糖 中间产物 a－酮戊二酸 NH4＋ 谷氨酸脱氢酶 谷 氨 酸 抑 制

  7. α-KGA + NH4+ +NADPH == GA + NADP • α-KGA NADPH α-KGA • L-谷氨酸脱氢酶 异柠檬酸脱羧氧化 • GA NADP 异柠檬酸

  8. GA的生物合成途径 （1）EMP:丙酮酸，ATP,NADH2 （2）HMP:6－磷酸果糖 3－磷酸甘油酸 NADPH2:－酮戊二酸还原氨基化必需的供氢体。 （3）TCA循环:生成谷氨酸前体物质－酮戊二酸。 （4）CO2固定反应:补充草酰乙酸。 （5）乙醛酸循环:使琥珀酸、延胡索酸和苹果酸的量得 （DCA循环） 到补充，维持TCA循环的正常运转。 谷氨酸脱氢酶 （6）还原氨基化反应:－酮戊二酸 谷氨酸 丙酮酸

  9. CO2固定反应 （1）在磷酸丙酮酸羧化酶的作用下 磷酸丙酮酸 + CO2 + GTP == 草酰乙酸 + GDP （2）在苹果酸酶的作用下 丙酮酸 + CO2 +NADH === 苹果酸 + NAD

  10. 需要Mn+做催化剂，所以，在GA发酵过程中需要向培养基中补充Mn+。需要Mn+做催化剂，所以，在GA发酵过程中需要向培养基中补充Mn+。

  11. EMP 3/2Glucose 丙酮酸 + 丙酮酸 + 丙酮酸 CO2 乙酰辅酶A + 乙酰辅酶A + 乙酰辅酶A 草酰乙酸 柠檬酸（DCA循环封闭） 不存在CO2固定反应 谷氨酸

  12. EMP Glucose 丙酮酸 + 丙酮酸 CO2 CO2 草酰乙酸 乙酰辅酶A + C4二羧酸 （草酰乙酸羧化酶） 苹果酸 （苹果酸合成酶） 柠檬酸（DCA循环封闭） 谷氨酸 存在CO2固定反应

  13. 封闭乙醛酸循环，不存在CO2固定反应： 3/2 C6H12O6 + NH4+→ C5H9NO4 + 4 CO2 产率：147 /（180*3/2） == 54.4% 封闭乙醛酸循环，存在CO2固定反应： C6H12O6 + NH4+ → C5H9NO4 + CO2 产率：147 / 180 == 81.7%

  14. 影响GA发酵糖转化率的其它因素： （1）GA发酵前期菌体增殖消耗葡萄糖（20%糖） （2）DCA 循环不可能完全封闭； （3）α-KGA不可能完全转化为GA； （4）生成的GA不可能完全分泌到细胞外； （5）残糖含0.5%-0.7%之间。

  15. 3.谷氨酸生产菌的生化特征 （1）生物素缺陷型。 （2）－酮戊二酸脱氢酶活性弱，异柠檬酸脱氢 酶活性强，异柠檬酸裂解酶活性弱。 （3）谷氨酸脱氢酶活性高，经呼吸链氧化NADPH2 的能力弱。 （4）菌体本身利用谷氨酸的能力低。 （5）有苹果酸酶和丙酮酸羧化酶。

  16. 下列关于谷氨酸产生菌的描述，哪些是正确的？下列关于谷氨酸产生菌的描述，哪些是正确的？ A：-酮戊二酸氧化能力微弱， B：谷氨酸脱氢酶活性强， C：具有向胞外分泌谷氨酸的能力， D：在菌体生长期乙醛酸循环弱， E：在产酸期乙醛酸循环弱， F：CO2固定能力弱。

  17. 下列关于谷氨酸产生菌的描述，哪些是正确的？下列关于谷氨酸产生菌的描述，哪些是正确的？ A：-酮戊二酸氧化能力微弱， √ B：谷氨酸脱氢酶活性强， √ C：具有向胞外分泌谷氨酸的能力， √ D：在菌体生长期乙醛酸循环弱， E：在产酸期乙醛酸循环弱， √ F：CO2固定能力弱。

  18. 4.谷氨酸产生菌（全是细菌） 棒杆菌属 北京棒杆菌 C. pekinense Corynebacterium 钝齿棒杆菌 C. crenatum 谷氨酸棒杆菌 C. glutamicum 短杆菌属 黄色短杆菌 B. flvum Brevibacterium 产氨短杆菌 B. ammoniagenes 小杆菌属 嗜氨小杆菌 M. ammoniaphilum Microbacterium 节杆菌属 球形节杆菌 A.globiformis Arthrobacter

  19. 我国使用的生产菌株是北京棒杆菌AS1.299、北京棒杆菌D110、钝齿棒杆菌AS1.542、棒杆菌S-914和黄色短杆菌T6~13等。

  20. 共同点： 1）革兰氏阳性。 2）菌体为球形、短杆至棒状 3）不形成芽孢。 4）没有鞭毛，不能运动。 5）需要生物素作为生长因子。 6）在通气条件下产谷氨酸（需氧微生物）。

  21. 表1部分氨基酸及其生产所用菌株

  22. 三、谷氨酸发酵的工艺控制 （一）培养基 1. 碳源：淀粉水解糖、糖蜜、乙醇、烷烃 玉米、小麦、甘薯、大米等 （1）淀粉水解糖的制备

  23. （2）糖蜜原料：甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜 还原糖的含量控制在10%～13%。 糖蜜预处理目的：降低生物素含量。 预处理方法：活性炭处理 先酸解后活性炭处理 先酸解后脱色树脂处理

  24. 味精生产的辅助材料包括硫酸、液氨、碳酸钠、 活性碳、液碱、盐、消泡剂、淀粉酶等。

  25. 2.氮源：铵盐、尿素、氨水 85%的氮源 谷氨酸 15%的氮源 菌体 C/N＝100:1521，实际高达100:28（GA发酵） C/N＝100:0.22.0 （一般发酵工业） 菌体生长期碳氮比应大一些(氮低） 产酸期,碳氮比应小些(氮高） 例如谷氨酸棒状杆菌的发酵过程 C/N＝3∶1 大量合成谷氨酸 C/N＝4∶1 只长菌体不产酸

  26. 发酵过程中补充氮源是因为： 1）用于调整pH。 2）分解产生的NH3从发酵液中逸出。 产酸阶段： NH4+不足：使-酮戊二酸蓄积而很少有谷氨酸生成。 NH4+过量：促使谷氨酸生成谷氨酰胺。

  27. 3.无机盐：磷酸盐、镁、钾、钠、铁、锰、铜，其中3.无机盐：磷酸盐、镁、钾、钠、铁、锰、铜，其中 磷酸盐对发酵有显著影响。 不足：糖代谢受抑制，菌体生长不足。 过多：a.细胞膜磷脂生成量多，不利于谷氨酸排出。 b.促进EMP途径，打破EMP与TCA之间的平衡， 积累丙酮酸。 c.促使丙酮酸和乙醛（由丙酮酸脱羧生成）缩 合生成缬氨酸的前体物——－乙酰乳酸， 使缬氨酸在发酵液中蓄积。

  28. Glucose 丙酮酸 + 丙酮酸 （焦磷酸硫胺素，TPP） 活性乙醛 α-乙酰乳酸 Val合成途径 Val Val（1）可以抑制葡萄糖 丙酮酸，使GA的生物合成受到阻止。 （2）消耗丙酮酸，降低了糖酸转化率。 （3）发酵液中的Val存在，严重的影响GA 的结晶、提取。

  29. 4. 生长因子：生物素 作用：影响细胞膜通透性和代谢途径。 生物素：B族维生素的一种，又称维生素H或辅酶R。是合成脂肪酸所必需的。 脂肪酸的生物合成： 利用乙酰CoA（直接原料是丙二酸单酰CoA）在乙酰CoA羧化酶（辅基为生物素）催化下合成。

  30. 葡萄糖 丙酮酸 + 丙酮酸 乙酰辅酶A 乙酰辅酶Ａ 乙酰辅酶A羧化酶 CO2 CO2 丙二酰辅酶A C4 丙二酰辅酶A CO2 C6 将乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A的酶是乙酰辅酶A羧化酶，该酶的辅酶是VH。

  31. 脂肪酸＋甘油磷酸 • 磷脂＋蛋白质 • 生物膜 • 因此，脂肪酸是组成细胞膜类脂的必要成分。 • 生物素限量，不利于脂肪酸的合成，有利于谷氨酸透过细胞膜分泌至体外。 • 培养基中生物素限量时，胞内AA 92% 胞外 • 培养基中生物素丰富时，胞内AA 12% 胞外

  32. （1）作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰（1）作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰 CoA的辅酶，参与脂肪酸的生物合成，进而影响 磷脂的合成，当磷脂合成量少到正常的1/2左右时, 细胞变形,Glu向膜外泄漏.

  33. （2）浓度过大：促进菌体生长，谷氨酸产量低。因为：（2）浓度过大：促进菌体生长，谷氨酸产量低。因为： a.乙醛酸循环活跃，-酮戊二酸生成量减少。 b.转氨酶活力增强，谷氨酸转变成其它氨基酸。 实际生产中通过添加玉米浆、麸皮水解液、糖蜜等作为生长因子的来源。

  34. 生物素（VH）对代谢的影响 （1）影响糖代谢 促进糖酵解 促进丙酮酸的有氧氧化——乙酰辅酶A的生成。 对前者促进大。

  35. 生物素可封闭乙醛酸循环 异柠檬酸裂解酶：为醋酸诱导、受琥珀酸阻遏 VH缺乏 丙酮酸氧化减弱 乙酰辅酶A少 琥珀酸积累 醋酸浓度降低

  36. 使胞内代谢产物迅速排出的方法 • 1. 用生理学手段—— • 直接抑制膜合成或使膜受缺损 • 如: Glu发酵中，控制生物素亚适量可大量分泌Glu； • 当培养液中生物素含量较高时采用适量添加青霉素的方法；

  37. 适量添加表面活性剂(如吐温60)或不饱和脂肪酸(C16-18)，也能积累谷氨酸。适量添加表面活性剂(如吐温60)或不饱和脂肪酸(C16-18)，也能积累谷氨酸。 机理:两者在脂肪酸合成时对生物素有拮抗作用，导致磷脂合成不足，形成不完整的细胞膜。 关键:控制好添加的时间和浓度，必须使菌体在这些药剂存在下进行分裂，形成产酸型细胞。

  38. 2. 利用膜缺损突变株 —— • 油酸缺陷型、甘油缺陷型 • 用油酸缺陷型生产菌，在培养过程中，有限制地添加油酸，通过控制油酸使磷脂合成量减少到正常量的1/2左右，合成有缺损的膜，使细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸产量。 • 控制关键：保证在培养基中油酸亚适量，完成细胞从生长型到生产型的转换。

  39. 甘油缺陷型菌株的细胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸大量渗漏。应用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或油酸过量的情况下，也可以获得大量谷氨酸。

  40. 控制细胞膜的渗透性 青霉素 生物素 细胞膜渗透性 谷氨酸 油酸缺陷型 谷氨酸 油酸 (1) 通过生理学手段控制细胞膜渗透性 (2) 通过细胞膜缺损突变控制细胞膜渗透性

  41. 工业上利用谷氨酸棒状杆菌大量积累谷氨酸，应采用的最好方法是（ ） A．加大菌种密度 B．改变碳源和氮源比例 C．改变菌体细胞膜通透性 D．加大葡萄糖释放量

  42. 为什么添加适量生物素或青霉素可提高谷氨酸产量？为什么添加适量生物素或青霉素可提高谷氨酸产量？ 生物素：乙酰-CoA羧化酶的辅酶，与脂肪酸及磷脂合成有关。控制生物素含量，可改变细胞膜的成分，改变膜的透性、谷氨酸的分泌和反馈调节。 生物素含量高时，细胞膜致密，阻碍Glu分泌，并引起反馈抑制，加适量青霉素可提高Glu产量。

  43. 青霉素：抑制谷氨酸生产菌细胞壁后期的合成。通过抑制肽聚糖合成中的转肽酶活性，引起肽聚糖结构中肽桥无法交联，造成细胞壁缺损。细胞膜失去保护，在渗透压的作用下受损，向外泄露谷氨酸，降低了谷氨酸的反馈抑制，提高了产量。青霉素：抑制谷氨酸生产菌细胞壁后期的合成。通过抑制肽聚糖合成中的转肽酶活性，引起肽聚糖结构中肽桥无法交联，造成细胞壁缺损。细胞膜失去保护，在渗透压的作用下受损，向外泄露谷氨酸，降低了谷氨酸的反馈抑制，提高了产量。 一般在进入对数生长期的早期(3-6小时)添加。

  44. 生物素营养缺陷型菌株的控制关键 必须限制发酵培养基中生物素亚适量(5-10g/L)。在发酵初期(0-8小时)，细胞正常生长，当生物素耗尽后，在菌的再次倍增时，开始出现异常形态细胞，即完成了细胞从生长型到积累型转换。

  45. （二）pH的影响及其控制 作用机理：主要影响酶的活性和菌的代谢。 在氮源供应充分和微酸性条件下，谷氨酸发酵转向谷氨酰胺发酵。 pH控制在中性或微碱性。 前期pH7.5~8.0，中后期pH7.0~7.6。 谷氨酸脱氢酶的最适pH为7.0～7.2 方法：流加0.8%尿素和氨水。

  46. （三）温度的影响及其控制 • 菌体生长达一定程度后开始产生氨基酸，菌体生长最适温度和氨基酸合成的最适温度不同。 • 菌体生长阶段：3032℃ • 谷氨酸脱氢酶的最适温度32~36℃ • 产酸阶段：3437℃

  47. （四）溶解氧的控制 大小由通风量和搅拌转速决定。 发酵前期以低通风量为宜；发酵中、后期以高通风量为宜。 不足：发酵液pH值偏低，生成乳酸和琥珀酸，谷氨酸少。 过大：NADPH2通过呼吸链被氧化，影响-酮戊二酸还原 氨基化，使-酮戊二酸蓄积。

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