UOC Anatomia Patologica Azienda Ospedaliera - Università degli Studi di Padova Dipartimento di Scienze Statistiche - Uni

1. 4° CONFRONTO INTERISTITUZIONALE IN PATOLOGIA MAMMARIA DA SCREENING L’attività proliferativa nel carcinoma della mammella: come valutarla? Dott. Enrico Orvieto UOC Anatomia Patologica Azienda Ospedaliera - Università degli Studi di Padova Dipartimento di Scienze Statistiche - Università degli Studi di Padova Padova 23-24 novembre 2011

2. Ki-67: Figlio di un Dio minore www.google.com Viale: SIAPEC Palermo 2011

3. Ki67 immunohistochemistry: a valuable marker in prognostication but with a risk of misclassification: proliferation subgroups formed based on Ki67 immunoreactivity and standardized mitotic index Jalava et al 2006 • Valori ≤15; >16 e ≤30; >30 discriminavano nelle pazienti endocrino responsive diverse categorie di rischio. • Valutazione effettuata su area periferica della neoplasia, con maggior proliferazione, contando 200 cellule St. Gallen 2009

4. Ki67 Index, HER2 Status, and Prognosis of Patients With Luminal B Breast Cancer Maggie C. U. Cheang et al. J Natl Cancer Inst. 2009 357 tumori della mammella studiati con gene expression profiles (50-gene PAM50) La distinzione tra Luminal A e B avviene prevalentemente sulla base dell’espressione di geni coinvolti nella proliferazione Nei 144 casi identificati come luminal (dalla metodica molecolare) si è individuato il cut-off del Ki67 (14%) in grado di separare i casi luminal A dai luminal B L’espressione IHC di ER, PgR, HER2 e di Ki67 (cut-off 14%), è stata utilizzata come surrogato alla classificazione molecolare dei Luminal in una casistica di oltre 4000 casi St. Gallen 2011

5. Ki67 Index, HER2 Status, and Prognosis of Patients With Luminal B Breast Cancer Cheang et al 2009 • Un core di 0,6 mm selezionato casualmente nel tessuto neoplastico • Percentuale di cellule positive sul totale delle cellule neoplastiche

6. “This study has several limitations. The main weaknesses of immunohistochemical approaches are limited technical reproducibility, subjective interpretation, and qualitative readouts . To facilitate analysis of suffi ciently large cohorts of samples, the immunostaining panel was trained and validated on tissue microarrays, whereas clinical implementation would likely occur on whole sections.” Cheang et al 2009

7. Eppure… Quantità di dati sul valore prognostico e predittivo di KI-67 A dispetto di: Uso di diversi materiali (TMA vs core biopsies vs intere sezioni) Differenti protocolli di colorazione Differente valutazione dei risultati Possiamo migliorare standardizzazione e riproducibilità? Viale: SIAPEC Palermo 2011

8. Le raccomandazioni internazionali Viale: SIAPEC Palermo 2011 J Natl Cancer Inst 2011; 103:1656-1664

9. Gradiente di Ki-67 Viale: SIAPEC Palermo 2011

10. Gradiente & hot spots Viale: SIAPEC Palermo 2011

11. Gradiente & hot spots ? Viale: SIAPEC Palermo 2011

12. The approach to scoring hot spots varies across studies; some investigators have focused in particular on the analysis of hot spots, others have included hot spots in a general assessment of Ki67 across the section, and yet others have recommended avoiding them altogether. This issue needs clarification, and a working party of the International Ki67 in Breast Cancer Working Group has been established to assess which method is more robust. In the meantime, for the purposes of consistency, when hot spots are present, an approach that assesses the whole section and records the overall average score is recommended. J Natl Cancer Inst 2011; 103:1656-1664

13. Spot 1: 90% Ki67 Spot 2: 30% Ki67 J Natl Cancer Inst 2011; 103:1656-1664

14. Valore medio tra spot 1 e 2 = 60% ki67 Spot 1: 180 cell Ki67 +/200 cell tumorali = 90% Ki67 Spot 2: 45 cell Ki67 +/150 cell tumorali = 30% Ki67 Somme delle cell positive per ki67 tra i due spot: 225/350 = 64% ki67

15. Data handling A threshold that is appropriate for determination of prognosis may not pertain to one that is used for eligibility for a neoadjuvant trial or for use of Ki67 as a pharmacodynamic marker. Currently, in the absence of harmonized methodology, the International Ki67 in Breast Cancer Working Group was unable, therefore, to come to consensus regarding the ideal cut point(s) that might be used in clinical practice. Recommendations Cut points for prognosis, prediction, and monitoring should only be applied if the results from local practice have been validated against those in studies that have defined the cutoff for the intended use of the Ki67 result.

16. Valutazione: 10 casi basso LI (rosa) Ventana + 30-9 = alto LI; score superiore: pregio o difetto? Necessaria correlazione clinica MIB1 e SP6 sovrapponibili

17. Il nostro studio prevedeva di valutare l’attività proliferativa con metodica immunoistochimica in 50 casi di carcinoma della mammella Cercando di evidenziare il metodo più corretto ed efficace per valutare l’attività proliferativa mediante l’espressione di ki67 Confronto tra metodiche di valutazione dell’attività proliferativa nel carcinoma della mammella

18. Ki67 colorazioni nella linea cellulare MCF-7 . A mitosi; dalla B alla F la fase precoce (G1); Nella G assente; da H a L confinate nei nucleoli. Dalla M alla Q con presenza congiunta nel nucleo e nella matrice nucleare ; R una cellula in profase caratterizzata da condensazione cromosomica

19. Tre regioni del diametro di 3mm ciascuna che sono state evidenziate con inchiostro permanente • Queste aree erano selezionate cercando di rappresentare l’eterogenea espressione dell’attività proliferativa della neoplasia.

20. Valutazione con reticolo Reticolo di 10 mm di lato diviso in 100 celle inserito nell’oculare del microscopio Per ogni regione vengono contati 3 reticoli

22. Analizzatore digitale Valutazione effettuata su ogni regione L’analizzatore è tarato per valutare un massimo di 350 cellule per area Valutazione routinaria Valutazione in percentuale di cellule proliferanti sul totale delle cellule Vengono valutate approssimativamente 500 cellule per area

23. Confronto con dato clinico dell’attività proliferativa

26. Il confronto tra la valutazione con analizzatore di immagini e la valutazione “manuale” effettuata con il metodo descritto si è dimostrata significativamente correlata

27. Era necessario esaminare l’area con 3 reticoli o si poteva diminuire il numero di reticoli contati? stabilito un livello di precisione si è calcolato quante griglie servono per arrivare alla stima della percentuale giusta col margine d'errore prefissato. La valutazione di una singola griglia era sufficiente per valutare correttamente l’espressione dell’attività proliferativa dell’intero campo identificato sul vetrino

28. L’unità “griglia” (100 celle contate) era il minimo da contare Il numero medio di cellule contate nelle griglie del nostro studio variava da 180 a 570

29. Per conoscere l’attività proliferativa dell’intera neoplasia sarebbe necessario suddividere la porzione infiltrante periferica della neoplasia in campi da 3mm di diametro e valutare una singola “griglia” per campo Valutazione estremamente onerosa in termini di tempo-lettura

30. Selezionato 20 dei 50 casi Selezione è avvenuta in maniera casuale bilanciando i diversi casi in funzione del grading Abbiamo valutato interamente la periferia della neoplasia costruito un algoritmo che individua, facendo tutte le possibili combinazioni casuali di aree, quante aree si devono contare per avere un margine d'errore accettabile.

31. Obbiettivo è quello di individuare il numero minore di aree, selezionate, in maniera casuale, che consentano di raggiungere il valore della conta di tutta l’area di proliferazione

32. Quanti campi, selezionati casualmente, sono necessari per ottenere il valore corretto dell’attività proliferativa dell’intera sezione neoplastica? Considerando una popolazione con differente attività proliferativa, per ottenere il valore dell’attività proliferativa più “corretto” è necessario valutare con il metodo descritto almeno 5 aree.

33. Un “errore” di valutazione del 10% dell’attività proliferativa può avere differente impatto clinico alla luce dei cut off che stanno emergendo dalla letteratura una variazione dal 40% al 44% del valore dell’attività proliferativa è dal punto di vista clinico ininfluente una variazione dal 13% al 14,3% del valore dell’attività proliferativa può essere discriminante

34. La valutazione dell’attività proliferativa con metodica immunoistochimica sembra assumere un significato clinico rilevante Cosa valutare? La massima attività proliferativa della neoplasia? L’attività proliferativa dell’intera neoplasia? Quali anticorpi anti ki-67 usare? Metodi automatici o valutazione “manuale? Necessaria la standardizzazione della valutazione

35. Conclusioni • La valutazione “manuale” se basata su concetti condivisi e con parametri certi è efficace quanto la valutazione con analizzatori di immagini computerizzati • Dal nostro studio emerge che per ottenere una valutazione più corretta dell’attività proliferativa è necessario valutare almento 5 regioni selezionate casualmente alla periferia della neoplasia • Che per ogni regione è sufficiente contare le cellule incluse nell’area di un reticolo, o in alternativa in un’area equivalente (0.0625 mm2 a 400x) • Che il numero di cellule contate è un parametro meno significativo rispetto ad un campionamento appropriato della regione proliferante della neoplasia

36. Conclusioni Le considerazioni espresse vanno comunque validate anche con una riproducibilità interlaboratorio In attesa di ulteriori “decisioni” delle linee guida In attesa della definizione di cut-off correlati a metodiche standard

37. Dott.ssa Giovanna Boccuzzo Dipartimento di Scienze Statistiche dell’Università di Padova Prof. Massimo Rugge Dott Marcello Lo Mele Dott.ssa Rajshree Sangapur Dott. Luciano Giacomelli UOC Anatomia Patologica Azienda Ospedaliera – Università di Padova