结核病细菌学检查的 重要作用 河南省疾病预防控制中心 结核病预防控制所 闫国蕊

1. 结核病细菌学检查的 重要作用 河南省疾病预防控制中心 结核病预防控制所 闫国蕊

2. 为了进一步加强结核病控制工作，实现国家结核病控制规划(NTP)目标，加强直接面视下短程化疗(DOTS)策略和结核病细菌学实验室质量控制，提高肺结核病人的发现率，通过实验室细菌学诊断传染性肺结核是实施DOTS策略的一个关键，而且对结核病控制项目的成功起着重要的影响作用。

3. 结核病细菌学检查的目的和任务 在结核病控制工作中痰结核菌检查对于发现传染源、确定诊断和化疗方案、考核疗效、评价防治效果具有重要意义。结核病细菌学检查是国家结核病控制规划(NTP) 的重要组成部分，在现代结核病控制工作中起着不可缺少的重要作用。

4. 实验室网络及职能 在国家参比实验室的管理和监督之下，以省级参比室为中心实验室，采用自上而下质量保证体系与同级实验室室间质控相结合的方式，建立我国实验室质量控制网络。网络中的各级实验室应有效地发挥各自的职能。

5. 我国参比实验室网络 NRL PRL PLL SNRL CLL SNRL：跨国参比实验室 NRL：国家参比实验室 PRL：省级参比实验室 PLL：地市级实验室 CLL：县级实验室

6. 何为DOTS? DOTS为 “directly 0bserved therapy shortcourse ”的缩写，中 文译为直接督导短程化疗，统称现代结核病控制策（DOTS）该策略１９９５年开始在全球推广，被认为是当今结核病诊治和管理的最有效方法。世界银行将 DOTS列为“成本效益比最高”的治疗方法之一。

7. 现代结核病策略 (DOTS)： 1.政府承诺 2.痰菌检查,发现病人 3.医务人员直接观察下的短程化疗 4.定期不间断的药品供应 5.信息监测系统 督导 药品 痰检 监测 承诺

8. 我国结核病疫情 目前有5.5亿的人口感染了结核菌(44.5%)估算全国现有活动性肺结核病人450万,其中传染性肺结核病人（涂阳肺结核）150万 据WHO估算,我国每年新发活动性肺结核病人145万,其中传染性肺结核65万例 每年因结核病死亡13万

9. 我省结核病疫情 河南是我国第一人口大省,人口达 9700多万，结核病疫情较为严重,已 被国家确认为结核病高负担省,我省 现有活动性肺结核病人46万（患病 率159/10万), 其中传染性病人15万（患病率497/10万),占全国肺结核病 人数10%。

10. 河南省结核病控制工作1993年在全国率先开展了“卫生部加强与促进结核病控制目”；1998年自筹资金开展“河南省结核病控制项目”；2002年实施“世行贷款/英国政府赠款/日本政府援助中国结核病控制项目”；2003年开展“全球基金项目”；河南省结核病控制工作1993年在全国率先开展了“卫生部加强与促进结核病控制目”；1998年自筹资金开展“河南省结核病控制项目”；2002年实施“世行贷款/英国政府赠款/日本政府援助中国结核病控制项目”；2003年开展“全球基金项目”；

11. 项目的实施使我省的结核病防治工作进入了全新的发展阶段。但是结核病防治工作并不尽如人意，疫情下降缓慢，结核病人的发现率低、耐药率高、治疗管理工作仍处于较低水平。项目的实施使我省的结核病防治工作进入了全新的发展阶段。但是结核病防治工作并不尽如人意，疫情下降缓慢，结核病人的发现率低、耐药率高、治疗管理工作仍处于较低水平。

12. 痰检质控文件1999年河南省结防所签发豫结防字（1999年）第10号文件《河南省结核菌检验质量控制标准》 2004年河南省卫生厅签发豫卫疾控（2004年）第91号文件《河南省结核病实验室痰涂片检查质量控制标准》

13. 结核病细菌实验室布局原则 一、结核病细菌学检查要有独立的实验室，不得 与其他实验室混用； 二、培养基制备、洗刷等相对洁净的操作与涂片镜检、培养前处理、药敏试验等污染操作要有独立分开的场所，最好分别在专用的房间进行； 三、基层只从事涂片镜检的实验室只拥有一间独立房舍的情况下，相对洁净区（镜检区、登记区）与污染区（涂片、染色区）要有明显区分。

14. 基层痰检室布局范例 可以开关的窗户 染色池 记录用 的桌子 显微镜 采 光 用 窗 户 （固定） 工作台 试 剂 柜 收集标本 用的桌子 实验室门

15. 结核菌检验实验室安全操作规则 结核菌检验实验室必须具有与其服务级别相应的装备，其原则是能满足该级别实验室的需要，使实验室人员得到充分的保护，并避免造成环境污染。

16. 安全操作规则（1） 1、实验室应有合理布局及合适的单向（外排）通风体系； 2、实验室应具备相应的防护设备，以保护工作人员的安全和实验工作的顺利进行。分离培养、药物敏感性测定、菌种鉴定试验等操作应设有生物安全操作柜或接种间和通风橱等；

17. 安全操作规则（2） 3、实验室工作人员应用正确方式进行技术操作，穿戴隔离衣、口罩和帽子等； 4、实验室所有带毒废弃物应灭菌及无害化处理； 5、建立清洁消毒制度，限制非工作人员进入室内，禁止在实验室饮食和吸烟等；

18. 安全操作规则（3） 6、进行下列操作时应严格按照技术规范，防止产生细菌气溶胶：①涂片制作；②培养液的倾倒和转移；③高速混合含菌液；④滴加、接种培养物； ⑤吸管稀释和混合菌悬液；⑥取样器和震荡器的使用；⑦细菌细胞超声粉碎；⑧感染动物实验等。

19. 分枝杆菌生物学基础 —简介 • 结核分枝杆菌是1882年郭霍（Rober -tKoch）从肺结核病人痰标本中发现,是人类结核病的主要病原菌。 • 分枝杆菌属裂殖菌纲,放线菌目,种类甚多,目前已命名的有56多种,一般可分为缓慢生长和快速生长两大类。

20. 结核菌生物学基础 —生物特性 分枝杆菌的形态: 结核分枝杆菌是专性需氧菌,无鞭毛、荚膜,无运动能力。 形状： 1.5 --3.5× 0.3 --0.6微米的细长杆状，直或稍弯，镜下常堆积成团、成束、排列杂乱无章，也有呈串珠样、链状、索状者。 萋-尼氏抗酸染色阳性,镜下的抗酸杆菌为淡兰色背景下的红色或粉红色细长杆菌。

21. 结核菌生物学基础 —生物特性 分枝杆菌的结构: 分枝杆菌由于细胞结构和细胞成分的特殊 性,具有经碱性燃料染色后能够忍受酸性介质 脱色的特征,具有其染色特征的细菌习惯上称 为抗酸菌(AFB). AFB菌体细胞结构的完整性与其抗酸染色 特性有着密切联系.用电子显微镜观察分枝杆 菌,完整的细胞结构主要有以下部分组成: 细胞壁、细胞膜、细胞质、核区、细胞器.

22. 结核菌生物学基础 —生物特性 抗酸性 • 抗酸性是分枝杆菌的重要特征。其化学基础是分枝菌属的细胞壁脂质含量较高，并含有大量分枝菌酸。 • 抗酸性与细菌细胞壁的完整性关系密切，若菌体自溶（如标本保存时间过长、温度过高）、结核菌的变异型（如L-型菌）可能失去抗酸性。

23. 结核菌生物学基础 —培养特性 • 生长适宜温度370C，PH6.8-7.2。营养要求较高。在常用的罗氏（Lowenstein-Jensen）培养基上生长的菌落粗糙、凸起、致密，有表面皱折，呈颗粒、结节或菜花样，乳白色或米色，不透明。 • 结核菌生长缓慢，在一般培养基上分裂一代需要10多小时，根据接种菌量的多少，一般10-30天肉眼可见菌落生长。

24. 结核菌检验方法 一、涂片法：直接涂片法 集菌法 二、培养法: 鸡蛋固体培养基法 （Lowenstein-Jensen） 快速培养法 三、动物试验 四、分子生物学诊断（PCR） 五、免疫学诊断

26. 各种方法可检出结核杆菌数量（个/ml 方法 直接涂片 集菌 培养 动物试验 PCR 菌数 10.000 1.000 100 10 1

27. 天数 天数 天数 1 2 9 512 17 131 072 2 4 10 1 024 18 262 144 3 8 11 2 048 19 524 288 4 16 12 4 096 20 1048 576 5 32 13 8 192 21 2097 152 6 64 14 16 384 28 268 416×103 7 128 15 32 768 35 34 535×106 8 256 16 65 536 42 4396 800×106 一条结核杆菌在体内的繁殖情况 结核杆菌数 结核杆菌数 结核杆菌数

28. 发现1个杆菌需 查视野数 涂片上的 杆菌数 每ml标本中 杆菌数 100 100 1000 10 1000 10000 1 10000 100000 排菌量 1ml痰液中含菌量为1000-10.000，其痰涂片阳性率为40％-50％

29. 痰涂片检查的意义

30. 一、痰菌检查是确定传染源的唯一方法 控制结核病流行以发现和控制传染源为主，痰涂片抗酸杆菌（AFB）阳性的肺结核患者是结核病的主要传染源，因此痰涂片AFB 镜检结果对诊断传染性结核病是一项重要指标。

31. 二、痰菌检查是确定化疗的依据 病人是否需要化疗，首先应以痰结果为准，如不查痰或查痰不对，就只能凭X线判断有无活动性，这样就可能将本来没有活动性、不需治疗的病人进行长期治疗。

32. 三、痰菌状况是流行病学重要指标 由于传染性结核病在流行病学中有着特殊的意义，因此在反映某一国家或地区结核病疫情严重程度的指标中，年感染率、涂阳患病率、涂阳发病率被更多关注。

33. 四、化疗方案的选择需以查痰 结果为根据 排菌病人：说明在病变中藏有大量繁殖旺盛的结核菌，需要有强有力的化疗方案，以达到迅速控制繁殖，短期内杀灭大部分结核菌的目的。 不排菌病人：一般病变中结核菌数量不大，繁殖不旺盛，就不必要用特别强的化疗方案。排菌与不排菌病人的治疗，在用药品种配伍、化疗时间管理方式上都有明显差别。

34. 五、化疗效果的考核 过去常以X线病变变化为考核治疗效果的指标，当前认为以痰菌阴转考核化疗效果更为合适。因为： 1、化疗作用在于直接杀灭病灶中的结核菌，痰菌的变化反映了病变的情况。 2、痰菌检查较X线更客观，误差较小，在各地、各人前后之间比较容易标准一致，可比性大。

35. 五、化疗效果的考核 3、化疗目的在于控制传染源 4、化疗情况下，痰菌变化比X线敏感。 5、有效化疗下，完成疗程，痰菌阴转后，即使X线阴影尚未完全吸收、硬结、稳定，也可以停药。

36. 化疗前后结核杆菌的定量分析 1976年Yeager报告对痰菌阳性病人在化疗前后做结核杆菌培养的定量分析: 化疗前每ml细菌数106-107， 化疗2周后减少至5％， 4周减少至0.25％,化疗后结核杆菌呈对数减少以至消失，降低了传染性。

37. 六、化疗中查痰要求 治疗方案 痰涂片检查 6个月方案 8个月方案 强化期 第2个月末 第2个月末 继续期中 第5个月末 第5个月末 治疗末 第6个月末 第8个月末

38. 痰涂片检查的优点 1.作为诊断手段,对传染性肺结核的诊断比x线准 确性高. 2.作为实验方法, AFB镜检方法技术相对简单. 3.建立AFB检查所需设备投入少. 4.检查成本低,易于接受. 5.报告结果时间短,能满足临床诊断的需求. 6.对阳性患者的治疗效果,能够作出及时和准 确的评价.

39. 检查对象 确定诊断： 凡因结核病症状求诊及转诊的可疑肺结核患者，均应进行直接涂片检查。一般包括持续咳嗽、咳痰超过3周；咳血或伴有血痰；发热或胸痛超过2周；胸部X线异常。确定诊断的涂片检查应采集3个合格的痰标本。就诊当时在门诊留一份“即时痰”标本，同时给患者2个痰盒，嘱患者留取“夜间痰”和“晨痰”，于次日交验。

40. 疗效评价： 凡已确诊、登记、治疗的肺结核患者，在化疗期间按照规定应定期查痰： 初治涂阳患者在疗程满2、5、6个月时，复治涂阳患者在疗程满2、5、8个月时，按期送检两份痰（当日即时痰、当或次日晨痰）。

41. 疗效评价： 初、复治涂阳患者在疗程满2个月时，痰菌仍为阳性者，应在延长期满1个月时增加检查一次；若复治涂阳患者治疗满3个月时痰菌仍阳性，应在治疗满5个月增加晨痰检查一次，送检两份痰（当日即时痰、当或次日晨痰）。 确诊、登记的涂阴肺结核患者，即使患者因故未接受治疗，也应在登记后满2个月和6个月时进行痰菌检查。

42. 痰标本的采集-1 容器： 采用WHO推荐的国际通用螺旋盖痰瓶，或可密封塑料盒、蜡纸盒收集痰标本（参考规格：直径4厘米，高度2厘米）。 痰容器应标明病人姓名、编号（初诊病人门诊序号或随访病人登记号）、检查项目和容器序号1、2、3（ 1＝当日即时痰，2＝夜间痰，3＝次日晨痰）。

43. 痰标本采集-2 按采集的时间，可将标本分为三类： 即时痰：就诊时深呼吸后咳出的痰液； 晨痰：患者晨起立即用清水漱口后，咳 出的第 2 口、第 3 口痰液； 夜间痰：送痰前一日，患者晚间咳出的 痰液；

44. 痰标本的采集-3 对疑似肺结核病者，临床医护人员应通过解释，使其充分了解标本质量对相应检查项目的重要性，示范并指导其掌握从肺部深处咳痰的方法；如患者识字，可提供宣教材料。(注意：由于当患者咳嗽、咳痰时易于产生含有结核菌的气溶胶，感染周边人群的机率较高，故采集痰标本时应在远离人群的开放空间进行，或在通风良好的室内进行。)

45. 痰标本的采集-4 患者留取的痰标本，应由检验人员或经培训的专人目视检查标本质量(特别是用于初次诊断的痰标本)：标本量一般在3-5 ml，标本性状属于干酪痰、褐色血痰或含少量新鲜血液的血痰、粘液痰者为合格的标本；痰标本不合格者，应予以进一步指导并要求其重新送检。进行细菌学检查时应在登记本和检验报告单上注明标本性状，以供分析结果时参考。

46. 标本的性状-1 合格的痰标本应是患者深呼吸后，由肺部深处咳出的分泌物。 干酪痰：标本外观以黄色(或奶酪色)、脓样、团块状的肺部分泌物为主，粘度较粘液痰低，制片时较易涂抹；涂片染色后镜检，可发现大量脓性炎症细胞、肺上皮脱落细胞。 血痰：此类标本是因粘液痰或干酪痰标本中混有血液而形成，颜色为褐色或深褐色、鲜红色或伴有血丝。

47. 标本的性状-2 粘液痰：标本外观以白色、粘稠度较高的肺部和支气管分泌物为主，制片时需仔细涂抹；涂片染色后镜检时，镜下可见支气管内膜纤毛柱状上皮细胞，伴有少量肺上皮脱落细胞、脓性炎症细胞、口腔脱落细胞及口腔寄生菌。此类标本的AFB检出率较唾液高。

48. 标本的性状-3 唾液：目视观察标本整体外观，以透明或半透明水样、粘度较低的口腔分泌物为主，标本中有时伴有气泡；涂片染色镜检时，镜下可见少量口腔上皮脱落细胞(形态不规则、细胞核着色较细胞质深，核质比接近或大于 1:2)和口腔内寄生菌，有时可见食物残渣。由于此类标本进行AFB检查时的检出率很低，用于对患者确定诊断时是不合格的标本。

49. 涂片抗酸染色检查方法-1 用于AFB检查的玻片要求： 一张栽玻片上只能涂抹一份痰标本； 每张栽玻片只能使用一次，不得清洗 后再次用于AFB涂片检查。

50. 涂片抗酸染色检查方法 -2 用于AFB检查的玻片要求： 在玻片正面一端的1/3处注明实验室序号及标本序号(如使用的载玻片一端无磨砂面，必须使用玻璃刻刀注明编号；如使用的载玻片一端有磨砂面，可使用2B铅笔在磨砂面上直接书写)。