H.J.Clarke, J.Rossant, Y.Masui

1. Indukcja rozwoju partenogenetycznego wywołana supresją kondensacji chromosomów podczas mejotycznego dojrzewania oocytów myszy. H.J.Clarke, J.Rossant, Y.Masui

2. Wprowadzenie • W jajnikach ssaków znajdują się oocyty I rzędu zatrzymane w profazie (diakineza) I podziału mejotycznego => faza wzrostu, synteza RNA i białek • Oocyty, które osiągnęły odpowiedni rozmiar (ok. 80 µm), są zdolne do wznowienia mejozy- na skutek stymulacji hormonalnej (in vivo) lub uwolnienia z jajnika i przeniesienia do hodowli (in vitro) • Rozpad pęcherzyka zarodkowego = zanik jądra oocytu => rozpoczęcie dojrzewania oocytu • I podział mejotyczny => wyrzucenie I ciałka kierunkowego • Bezpośrednio po I podziale mejotycznym- uformowanie wrzeciona II podziału => oocyty zostają zahamowane w metafazie II => owulacja • Zatrzymane w metafazie II oocyty mogą rozpocząć dalszy rozwój (dokończenie II podziału mejotycznego i rozpoczęcie interfazy I cyklu komórkowego) w wyniku: • zapłodnienia; • aktywacji partenogenetycznej; • krótkiej inhibicji syntezy białek.

3. Białka syntetyzowane przez oocyt w czasie kolejnych stadiów podziału mejotycznego są odpowiedzialne m.in. za: • Utrzymywanie oocytu w stadium metafazy II • Utrzymywanie chromosomów w stanie skondensowanym Podanie inhibitora syntezy białek (puromycyna) powoduje: • Dekondensacje chromosomów => powstanie jądra interfazowego • Oocyty w metafazie I => po wycofaniu inhibitora powrót do stadium metafazy w ciągu 8 – 10 h • Oocyty w metafazie II => pozostanie w stadium interfazy i rozpoczęcie pierwszego podziału mitotycznego (początek partenogenetycznego rozwoju zarodkowego)

4. Oocyty, potraktowane w metafazie I puromycyną, można zatrzymać w stadium interfazy przez podanie dwumaślanu cyklicznego AMP (dbcAMP) => zapobiega syntezie białek odpowiedzialnych za kondensację chromosomów. Cel eksperymentu: • Sprawdzenie, czy oocyty zatrzymane w interfazie pod wpływem dbcAMP są w stanie rozpocząć rozwój zarodkowy • Zbadanie zdolności tych oocytów do podejmowania replikacji DNA i podziałów komórkowych

5. Metody i materiały- doświadczenie 1 • Myszy ze szczepu HS lub CD1 otrzymały zastrzyk z serogonadotropiny źrebnych klaczy (5 j./mysz) => zabite po 44 – 48 h od podania hormonu • Oocyty wykłuwane z jajników w pożywce z dbcAMP (50 µg/ml) => zapobieganie spontanicznemu rozpadowi pęcherzyka zarodkowego • 100 – 200 w pełni wyrośniętych, niedojrzałych oocytów zawierających nienaruszony pęcherzyk zarodkowy • Inkubacja niedojrzałych oocytów w pożywce nie zawierającej dbcAMP (5% CO2, 37º C): • przez 8 – 9 h => wybranie oocytów, które przeszły rozpad pęcherzyka zarodkowego (nie posiadających jądra), ale nie wyrzuciły ciałka kierunkowego => oocyty w metafazie I • przez 20 h => wybranie oocytów, które przeszły rozpad pęcherzyka zarodkowego i wyrzuciły pierwsze ciałko kierunkowe => oocyty w metafazie II

6. Metody i materiały- doświadczenie1 oocyty pożywka z puromycyną [10 µg/ml, 9 h lub 50 µg/ml, 4.5 h] pożywka bez puromycyny [+ metylotymidyna znakowana trytem] z dbcAMP bez dbcAMP [100 µg/ml] • Inkubacja prowadzona przez 30 h • Próbki pobierane od 2 do 30 godziny inkubacji - autoradiografia

7. Wyniki- doświadczenie 1 Oocyty w metafazie II: • Początkowo 59%, po powtórzeniu eksperymentu 82%, wyrzuciło II ciałko kierunkowe i osiągnęło stadium przedjądrza • Po wycofaniu puromycyny rozpoczynały syntezę DNA bez względu na obecność lub brak w pożywce dbcAMP • Ok. 50% zaktywowanych oocytów rozpoczęło syntezę DNA w ciągu 6 h od usunięcia puromycyny (<= wynik podobny do otrzymywanych przy badaniu zapłodnienia lub aktywacji partenogenetycznej) Oocyty , potraktowane puromycyną w stadium metafazy II, rozpoczynają replikację DNA po wycofaniu puromycyny.

8. Wyniki- doświadczenie 1 Rozpoczęcie syntezy DNA przez oocyty traktowane puromycyną. oocyty w metafazie II inkubowane z dbcAMPoocyty w metafazie II inkubowane bez dbcAMP oocyty w metafazie I inkubowane z dbcAMP oocyty w metafazie I inkubowane bez dbcAMP

9. Wyniki- doświadczenie 1 Oocyty w metafazie I: • Od 50% do 90% wyrzuciło ciałko kierunkowe i osiągnęło stadium z jądrem • Inkubowane bez dbcAMP • Wróciły do stadium metafazy w ciągu 8-10 h od wycofania puromycyny puromycyna nie aktywowała ich do podziału • Żaden nie rozpoczął syntezy DNA b) Inkubowane z dbcAMP • Większość z nich pozostała w interfazie do końca eksperymentu (30h) inkubacja w obecności dbcAMP utrzymuje oocyty w interfazie po wznowieniu syntezy białek Stabilizacja interfazy przez dbcAMP. symbole pełne- inkubacja z dbcAMP symbole puste- inkubacja bez dbcAMP

10. Wyniki- doświadczenie1 • Żaden z oocytów nie rozpoczął syntezy DNA przed upływem 10 h od wycofania puromycyny • Ok. 50% rozpoczęło syntezę DNA do 20 h od wycofania inhibitora • 90% rozpoczęło syntezę DNA do końca trwania eksperymentu • Kontrola- oocyty, które nie zostały poddane działaniu puromycyny, ale były inkubowane w pożywce zawierającej dbcAMP => wszystkie pozostały w metafazie i żaden nie rozpoczął syntezy DNA Choć puromycyna nie aktywuje oocytów w stadium metafazy I, to mogą one rozpocząć syntezę DNA, jeśli umożliwi im się kontynuację syntezy białek i utrzyma się je w interfazie.

11. Metody i materiały- doświadczenie2 oocyty w metafazie I pożywka z puromycyną [50 µg/ml, 4.5 h] pożywka z dbcAMP pożywka bez dbcAMP [100 µg/ml, 15 h] [kontrola] oocyty posiadające jądro oocyty w metafazie przeszczep do macicy zastępczej matki [0.5 dnia ciąży rzekomej] • Po 2 dniach- wypłukanie oocytów z macicy • Oocyty, które rozpoczęły podział => inkubowane przez 48 h i badane

12. Wyniki- doświadczenie 2 Oocyty inkubowane z dbcAMP: • 22% oocytów, wypłukanych z macic zastępczych matek, osiągnęło stadium 4- lub 8- komórkowe (pozostałe znajdowały się w stadium 2- komórkowym lub uległy fragmentacji) • 4- i 8- komórkowe zarodki inkubowane przez 48 h => 40% osiągnęło stadium blastocysty • Analiza kariotypów blastocyst => diploidalne (rozwinęły się z oocytów, które nie przeszły II podziału mejotycznego) Oocyty inkubowane bez dbcAMP: • Żaden z oocytów nie zaczął się dzielić po przeszczepie do macicy biorczyni => wykluczenie możliwości, że transfer do macicy mógł pobudzić oocyty do rozwoju partenogenetycznego Oocyty potraktowane puromycyną w metafazie I, a następnie utrzymane w interfazie pod wpływem dbcAMP, rozpoczynają partenogenetyczny rozwój zarodkowy.

13. Wyniki- doświadczenie 2 Rozwój oocytów poddanych działaniu puromycyny w metafazieI

14. Wnioski Oocyty w metafazie I, poddane działaniu puromycyny i dbcAMP, mogą rozpocząć syntezę DNA pytanie Czy to synteza w celu replikacji czy reperacji DNA? 2 dowody za replikacją • Nigdy nie obserwowano replikacji DNA w oocytach po puromycynie, ale bez dbcAMP, które wracały do metafazy, chociaż z wcześniejszych badań wiadomo, że synteza „reperacyjna” może zachodzić w oocytach w metafazie. • W eksperymencie synteza DNA nie rozpoczynała się wcześniej, niż przed upływem 10 h od wycofania puromycyny, a synteza „reperacyjna” może się rozpocząć już po 2 h po ekspozycji na czynniki uszkadzające DNA. wniosek Synteza obserwowana w eksperymencie = faza S pierwszego podziału zarodkowego.

15. Wnioski Oocyty w metafazie II poddane działaniu puromycyny, zaczynają syntezę DNA po 6 h od wycofania puromycyny, a oocyty w metafazie I- najwcześniej po 10 h. Wejście w interfazę jest niewystarczające do rozpoczęcia syntezy DNA. Do wejścia w fazę syntezy potrzebne są jakieś dodatkowe czynniki, których nie ma w cytoplazmie oocytów w metafazie I, ale pojawiają się po dokończeniu syntezy białek. • Zahamowanie podziału oocytów w metafazie II musi zależeć od krótko żyjących białek. • Blok w metafazie II jest regulowany przez krótko zyjące, specyficzne dla metafazy kinazy i fosforylazy.

16. Czynnik MPF Mitosis Meiosis MPFMaturation Promoting Factor M- phase Czynnik biorący udział w zapoczątkowywaniu podziałów komórkowych (mitotycznych i mejotycznych). MPF= kinaza cdc2 (p34, CDK) + cyklina B • Kinaza cdc2- podjednostka katalityczna, stały poziom w cyklu kom. • Cyklina B- podjednostka regulatorowa, poziom cyklicznie zmieniający się w trakcie cyklu kom. Regulacja aktywności CDK: • przejściowe połączenie ze specyficznymi cyklinami • oddziaływanie z inhibitorami białkowymi • odwracalna fosforylacja

17. Procesy zależne od MPF Rozpoczęcie dojrzewania mejotycznego (przejście G2/M) => MPF katalizuje fosforylację białek: • histon H1, białka z grupy HMG => kondensacja chromatyny w jądrze • laminy otoczki jądrowej => rozpad pęcherzyka zarodkowego • nukleolina => rozpad jąderek • czynniki transkrypcyjne => represja transkrypcji • wpływ na dynamikę polimeryzacji i depolimeryzacji mikrotubul => formowanie wrzeciona podziałowego

18. Aktywacja MPF • połączenie kinazy cdc2 z cykliną B • fosforylacja treoniny 161 (in vivo: CAK- CDK Activating Kinase, in vitro: kompleks cdk7/cyklina H), treoniny 14 i tyrozyny 15 (kinaza białkowa Wee1 lub Myt1) • defosforylacja treoniny 14 i tyrozyny 15 (fosfataza cdc25 aktywowana przez kinazę POLO i MPF /pozytywne sprzężenie zwrotne/) • fosforylacja cykliny B (kinaza Cyk)

19. Proteolityczna degradacja cykliny B: Wysoki poziom MPF w metafazie aktywuje kompleks APC (Anaphase Promoting Complex) Aktywny APC katalizuje ubikwitynizację cykliny B (i białek zaangażowanych w połączenia chromatyd siostrzanych) Cyklina B połączona z ubikwityną kierowana jest do proteasomu, gdzie zachodzi jej degradacja Inaktywacja APC zachodzi w fazie G1 i jest katalizowana przez kinazy CDK charakterystyczne dla tej fazy Inaktywacja MPF (metafaza/anafaza)

20. Aktywny MPFpowoduje rozpad otoczki jądrowej i formowanie wrzeciona podziałowego => rozpoczęcie dojrzewania mejotycznego. Stopniowe narastanie aktywności MPF => maksimum aktywności w metafazie I. Przejściowy spadek aktywności MPF podczas wyrzucania I ciałka kierunkowego. Ponowna aktywacja MPF po wyrzuceniu ciałka => synteza cykliny B tworzącej kompleks z cdc2. Maksimum aktywności MPF w stadium metafazy II=> utrzymanie wysokiej aktywności MPF aż do zapłodnienia albo aktywacji partenogenetycznej (CSF, MAP). Rola MPF w regulacji dojrzewania mejotycznego

21. Rola MPF w regulacji dojrzewania mejotycznego

22. Podsumowanie • Oocyty w metafazie II- degradacja MPF powoduje wejście w interfazę pierwszego podziału cyklu komórkowego • Oocyty w metafazie I inkubowane bez dbcAMP- synteza cykliny B, odtworzenie MPF => powrót do metafazy • Oocyty w metafazie I inkubowane z dbcAMP- hamowanie syntezy cykliny B, brak MPF => wejście w interfazę pierwszego podziału komórkowego

23. KONIEC