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流式细胞术

流式细胞术. （ Flow Cytometry ,FCM ）. 利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达 1000-10000 个）的定量分析和分选（纯度可达 99% 以上）的技术。. 荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。. 标本处理. 免疫荧光标记 直接免疫荧光标记 间接免疫荧光标记. 流式细胞术常规检测时的样品制备.

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流式细胞术

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  1. 流式细胞术 （ Flow Cytometry ,FCM）

  2. 利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。

  3. 荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。荧光信号主要包括两部分：①自发荧光，即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光；②特征荧光，即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光，其荧光强度较弱，波长也与照射激光不同。自发荧光信号为噪声信号，在多数情况下会干扰对特异荧光信号的分辨和测量。

  4. 标本处理 免疫荧光标记 直接免疫荧光标记 间接免疫荧光标记

  5. 流式细胞术常规检测时的样品制备 （一）直接免疫荧光标记法  取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上,再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入) 。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。

  6. 直接荧光标记法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。直接荧光标记法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。

  7. (二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。(二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。

  8. 本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。

  9. 最小化非特异性结合的方法

  10. 常用的荧光染料（488波长激发） • 荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色 • FITC 488 525 免疫荧光 绿色 • PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 • ECD 488 620 免疫荧光 橙红 • PeCy5 488 675 免疫荧光 红 • PI 488 620 DNA染色 橙红 • PECy7 488 755 免疫荧光 深红 • 7AAD 488 675 区分死细胞 • 其中PE最强，使用于弱表达抗原 • FITC最便宜，使用于强表达抗原

  11. 培养细胞 • 制作细胞悬液 • 300-400目滤网过滤 • 免疫荧光标记 • 上机

  12. 流式细胞术检测培养细胞表面抗原的样品制备方法探讨流式细胞术检测培养细胞表面抗原的样品制备方法探讨 • 应用EDTA、胰酶、细胞刮、联用EDTA及细胞刮制备 • 单用EDTA或细胞刮制备的细胞悬液中细胞产量低,胰酶或联用EDTA及细胞刮制备的细胞悬液中细胞产量高(F=263.63,P＜0.001).胰酶组细胞表面HLA-DR和ICAM-1的荧光强度明显降低,且以HLA-DR抗原下降比例较多(HLA-DR:F=3.77,P=0.022;CD54:F=10.33,P＜0.001).EDTA组、细胞刮组、EDTA联合细胞刮组间HLA-DR和ICAM-1的荧光强度表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论:EDTA联合细胞刮法是贴壁培养细胞制备单细胞悬液的一种好方法

  13. 操作步骤 • 制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、　　　　　胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　用10％FCSRPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)　　　　　　　　的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS　　　　　　　　稀释)灭活正常兔血清　　　　　　　　　　　　　　　　　↓4℃ 30min　　　　　　　　用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　4℃ 30min　　　　　　　　　用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　　　　　　加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，　　　　　　　　　视细胞浓度加入100～500μl固定液)　　　　　　　　　　　　　　　　　↓FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5～7天)

  14. 1. DPBS (×10, 贮存液)NaCl 80gKCl 2g 　　　　　蒸馏水加至1000mlNa２HPO４ 11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释KH２PO４ 2g2.　洗涤液DPBS900mlFCS 50ml (终浓度　5％)4％NaN３50ml (终浓度0.2％)3.　固定液DPBS1000ml　　　　葡萄糖　　　　20g (终浓度2％)　　　　甲　醛　　　　10mlNaN３　　　0.2g (终浓度0.02％)

  15. 注意事项 • 1.　整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。2.　洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。3.　加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。4.　细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。

  16. 注意事项 • 细胞数目，标记细胞数目在5*105到1*106内为宜，将液体量控制在100-200微升。 • 必须经过微栅过滤。 • 培养细胞类型，大小。 • 注意孵育条件，试剂说明上都有标记，大多数为室温，避光孵育，有的试剂要求4℃条件下孵育。 • 阴性对照。

  17. 血细胞 流式检测 • 抗凝。 • 除红细胞标记检测外需要溶血。 • 血标本取出后6小时内进行荧光染料标记，溶血固定后（含多聚甲醛）可保存2-3天。 • 注意孵育环境，试剂说明上都有标记，大多数为室温，避光孵育，有的试剂要求4℃条件下孵育。 • 标记细胞数目在5*105到1*106内为宜，将液体量控制在100-200微升。 • 如血标本中有血凝块或其他絮状物、沉淀不可上机检测，以防止堵塞流路通道。

  18. 氯化铵溶血剂(Ammonium chloride lysing solution,) • 贮存液(10′)：80.2g NH4Cl (1.5M)8.4g NaHCO3(100mM)3.7g EDTA Na2(10mM)蒸馏水900 ml调节pH至7.4 (用1N HCl 或NaOH)加蒸馏水至1升4oC保存6个月以内 • 工作液(1′)：蒸馏水1:9稀释, 新鲜配制, 冷藏保存 • 注: 1) 贮存液不可小于10′, 否则会形成碳酸铵而失效2) NaHCO3可由10g KHCO3替代, EDTA Na2可由3.66g EDTA Na4(8.2mM)替代

  19. 用氯化铵溶血剂的溶血方法 • 100ml 全血加2mL氯化铵溶血剂, 混匀2) 避光孵育10~15分钟3) 离心, 去上清, PBS洗2次4) 抗体染色后, PBS洗5) 1ml 1%多聚甲醛固定, 2oC-直至上机检测

  20. 细胞凋亡 流式检测 • 固定细胞的染色方法 • 非固定细胞的染色方法

  21. 固定细胞的染色方法

  22. PI单染色法 （1） • 1．收集细胞（1～5）×106个，500～1000r/min离心5min，弃去培养液。 • 2．3ml PBS洗一次。 • 3．离心去PBS，加入冰预冷的70％的乙醇固定，4℃，1h。 • 4．离心弃去固定液，3ml PBS重悬5min。 • 5．400目的筛网过滤1次，500～1000r/min离心5min，弃去PBS。 • 6．用1ml PI染液，4℃避光30min。 • 7．流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光，可分析前散射光对侧散射光的散点图及PI荧光的直方图。

  23. PI单染色法 （2） • 1．收集细胞（1×106个），500～1000r/min离心5min，弃去培养液。 • 2．1ml PBS/FCS洗一次。 • 3．500～1000r/min离心5min去PBS/FCS，加入500μl PBS/FCS和500μl的多聚甲醛固定液，轻轻混匀，在4℃下固定4min。 • 4．500～1000r/min离心5min弃去固定液，室温加入含0.2％ Tween的PBS 1ml，37℃孵育15min。 • 5．1ml PBS/FCS洗3次，每次5min。 • 6．400目的筛网过滤1次。 • 7．500～1000r/min离心5min去PBS/FCS，用1.0ml PI染液，4℃避光至少30min。染色在24h之内皆可行，流式细胞仪分析。

  24. 调亡细胞的TUNEL的流式细胞仪分析 • 1．离心收集细胞，PBS洗1～2次。 • 2．1％多聚甲醛低温下固定15min。 • 3．3ml PBS洗1次，70％乙醇固定，冰箱内放置1～3天。 • 4．PBS轻洗1次 • 5．细胞与TdT标记液37℃孵育，时间1～2h。 • 6．PBS轻洗1次。 • 7．细胞在黑暗中37℃与100μl的染色缓冲液孵育30min。 • 8．含0.1％ Triton-X 100的PBS轻洗1次。 • 9．1ml PBS（含5mg/ml PI, 0.1% RNase A）重悬。 • 10．  流式细胞仪分析红色（PI）对绿色荧光（FITC）的地形图。

  25. ISNT的流式细胞仪分析 • 1．离心收集细胞，PBS洗1～2次 • 2．1％多聚甲醛低温下固定15min。 • 3．3ml PBS洗1次，70％乙醇固定，冰箱内放置1～3天。 • 4．PBS轻洗1次。 • 5．2×105细胞与12.5μl的缺口平移缓冲液在15℃共孵育6h，每过15min振动1次。 • 6．PBS轻洗1次。 • 7．细胞在黑暗中37℃与100μl的染色缓冲液孵育30min。 • 8．含0.1％ Triton-X 100的PBS轻洗1次。 • 9．1ml PBS（含5mg/ml PI, 0.1% RNase A）重悬。 • 10．  流式细胞仪分析红色（PI）对绿色荧光（FITC）的地形图

  26. 非固定细胞的染色方法

  27. Hoechst 33342/PI双染色法 • 1．悬浮生长的细胞在培养状态下加入Heochst 33342，终浓度为1μg/ml；帖壁生长的细胞用含有0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，离心，弃上清，用1ml全培养液重悬细胞，加入Heochst 33342，终浓度为1μg/ml，37℃孵育7～10min。 • 2．4℃ 500～1000r/min离心弃去染液。 • 3．加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min。 • 4．400目的筛网过滤1次。 • 5．流式细胞仪分析。

  28. Annexin V/PI双染色法 • 1．细胞收集：悬浮细胞直接收集10ml的离心管中，而帖壁细胞先用滴管轻轻吹打，调亡细胞一经吹打可能脱壁，收集到10ml的离心管中，没脱壁的细胞用0.02％的EDTA消化使之脱壁，每样本细胞数为（1～5）×106，500～1000r/min离心5min弃去培养液。 • 2．用孵育缓冲液洗1次，500～1000r/min离心5min。 • 3．用100μl的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10～15min。 • 4．500～1000r/min离心5min沉淀细胞，孵育缓冲液洗1次。 • 5．加入荧光溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。

  29. 细胞因子检测 • 常用的标本类型和处理方法 • 全血：使用肝素钠抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素锂、EDTA和ACD抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。 • 自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs)：使用肝素钠抗凝的采血后，分离PBMCs，24小时内分析。 • 组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs)：用Ficoll分离PBMCs，将细胞重悬于含10%热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI－1640培养基中，调节细胞浓度为2×106细胞/ml。 • 细胞系与T细胞克隆：调节细胞浓度2×106细胞/mL于新鲜培养基中。 • 冰冻全血与PBMCs：使用1×红细胞裂解液处理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重悬，－70℃冻存。溶化后细胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，离心5分钟后，用破膜剂对细胞进行破膜和染色。

  30. 流式检测细胞染色基本过程（以全血为例） • 1、收获细胞：肝素钠抗凝的静脉血，按1：1与培养基混匀，加刺激剂，同时加蛋白转运抑制剂（参照说明书）， 混匀后，37℃，5%二氧化碳培养4-6小时 • 2、阻断Fc受体：用于消除非特异性的结合染色 • ①在小鼠，可使用纯化的FcII/III受体的抗体（CD16/32），按照1ug/106细胞的用量，在染色缓冲液中4℃孵育15分钟，PBS清洗后，直接进行下一步染色。 • ②对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型不相关的纯化Ig或者血清进行阻断 • 3、细胞表面染色 • ①加适当的细胞表面染色试剂20L于Falcon管中，加入100L激活后的全血 (细胞浓度维持在2×106/mL) 混匀，室温暗处孵育15分钟； • ②加入溶血素，室温暗处孵育10分钟。（注意：PMA激活的全血可能会溶血不完全。） • ③离心500g 5分钟，弃上清 • 4、固定和破膜 • ①加固定剂，室温暗处孵育15分钟，离心500g 5分钟，弃上清； • ②加破膜剂温暗处孵育10分钟。（剂量参照说明书） • ③加2~3mLPBS洗液，离心500g 5分钟，弃上清。 • 5、细胞内染色 • ①加入荧光标记的细胞因子抗体，混匀，室温暗处孵育30分钟。 • ②加2~3mL洗液，离心500g 5分钟，弃上清，加入500LPBS上机或加入500L 1% PFA固定后再上机

  31. 流式细胞术分析血小板 • 全血样本的制备 • 1.抽取抗凝全血：检测血小板功能时，应使用标准化的抽血规程。做血小板活化试验时，应尽量减少人为造成的血小板活化。 • 2.Falcon管中加取全血和适量直标荧光抗体，充分混匀，室温避光处反应，通常放置15分钟。 • 3.1%多聚甲醛固定样本。 • 4.上机检测

  32. 质控标本 • .阴性对照(Isotype Control)：非特异荧光的强弱取决于抗体浓度、单克隆荧光抗体特异性和纯度，应与试验管抗体相对应。在多色分析时，同型对照应与其它抗体同时使用，以避免补偿造成的误差。 • 2. 血小板体外活化试验：使用正常人活化标本作为阳性质控。使用正常人未活化标本作为阴性质控。 • 3. 血小板自身抗体检测：使用含有已知血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阳性质控。使用不含血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阴性质控。 • 4. 血小板表面抗原缺失：如巨血小板症血小板表面CD42a/CD42b缺失，血小板无力症血小板表面gpIIb/IIIa，即CD41/CD61缺失或异常。使用正常人标本做阳性对照，抗体的同型对照做阴性对照

  33. 流式细胞仪的调试和使用 • ①打开电源，对系统进行预热； • ②打开气体阈，调节　压力，获得适宜的液流速度；开启光源冷却系统； • ③在样品管中加入去离子水，冲洗液流的喷嘴系统； • ④利用校准标准样品，调整仪器，使在激光功率、光电倍增管电压、放大器电路增益调定的基础上，0。和90。散射的荧光强度最强，并要求变异系数为最小； • ⑤选定流速、测量细胞数、测量参数等，在同样的工作条件下测量样品和对照样品；同时选择计算机屏上数据的显示方式，从而能直观掌握测量进程； • ⑥样品测量完毕后，再用去离子水冲洗液流系统； • ⑦因为实验数据已存入计算机硬盘（有的机器还备有光盘系统，存贮量大），因此可关闭气体、测量装置，而单独使用计算机进行数据处理； • ⑧将所需结果打印出来。

  34. 在操作和使用中一定要注意如下事项：　 • 1）光电倍增管要求稳定的工作条件，暴露的较强的光线下以后，需要较长时间的“暗适应”以消除或降低部分暗电流本底才能工作；另外还要注意磁屏蔽； • 2）光源不得在短时间内（一般要1h左右）关上又打开；使用光源必须预热并注意冷却系统工作是否正常； • 3）液流系统必需随时保持液流畅通，避免气泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要经过过滤、消毒； • 4）注意根据测量对象的变换选用合适的滤片系统、放大器的类型等； • 5）特别强度每次测量都需要对照组。

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