versatilità

1. qualitativa & quantitativa colonne riutilizzabili alta sensibilità non distruttiva alte pressioni applicate in testa alla colonna buone risoluzioni velocità di analisi versatilità alta efficienza HPLC colonne impaccate con particelle di piccole dimensioni High Pressure Liquid Chromatography High Performance Liquid Chromatography

2. HPLC LC HPLC

3. HPLC - STRUMENTAZIONE • può contenere accessori per • riscaldare • degassare • agitare • il solvente o la miscela di solventi 300-7000 psi  20-480 atm 1 psi = 0.068 atm = 6.894 kPa RISERVA DI SOLVENTE SISTEMA DI GRADIENTE POMPE INIETTORE PRE-COLONNA e/o COLONNA MISURATORE DI FLUSSO REGISTRATORE RIVELATORE COLLETTORE DI FRAZIONI DATA SYSTEM

4. HPLC - STRUMENTAZIONE • REQUISITI DELLO STRUMENTO: • massima resistenza alla corrosione • resistenza ad alte pressioni di testa e flussi elevati • volumi morti minimi in connessioni, iniettore, rivelatori • velocità di flusso costante con precisione < 0.2%  tR

5. HPLC - STRUMENTAZIONE POMPA: è fondamentale per ottenere una velocità di flusso costante riproducibilità dei tR velocità costante Le pompe a pistone sono le più utilizzate, ma producono un flusso pulsato, che interferisce con i rivelatori. Di solito i cromatografi con pompe a pistone sono muniti anche di uno smorzatore di flusso. Alternativamente, per smorzare il flusso, si mettono alcuni pistoni in serie, con moti sfalsati, così da mediare l’uscita del flusso.

6. HPLC - STRUMENTAZIONE composizione della fase mobile costante nel tempo isocratica gradiente composizione della fase mobile variabile 1 pompa x ogni solvente + camera di mescolamento apparecchio di miscelazione + pompa GRADIENTE eluizione

7. HPLC - STRUMENTAZIONE automatizzato x analisi in serie con valvole diretta in colonna o pre-colonna caricamento iniezione INIETTORE iniezione = trasferimento del campione nel loop per portarlo alla pressione di esercizio del cromatografo = la rotazione di una valvola devia il flusso della fase mobile nel loop e trasporta il campione in colonna

8. HPLC - STRUMENTAZIONE ad acqua contiene ad aria fasi con particelle di forma irregolare - 20-60 mm fasi con particelle microsferiche - 3-10 mm COLONNE forno termostatico • la colonna • il rivelatore •  • proprietà dell’analita influenzate da T COLONNE

9. HPLC - STRUMENTAZIONE UNIVERSALI misurano variazioni delle proprietà del’eluato dipendenti dalla composizione • indice di rifrazione • calore d’assorbimento • ionizzazione di fiamma • UV • fluorescenza • elettrochimici • conduttività elettrolitica • polarografici SELETTIVI (x classi di composti) misurano proprietà chimiche e/o fisiche del soluto distruttivi non distruttivi SPECIFICI rivelano solo composti con determinate caratteristiche • radioattività • chirali RIVELATORI RIVELATORI

10. HPLC versatilità elevata sensibilità monitoraggio continuo dell’effluente della colonna linearità di risposta basso livello di rumore linea di base stabile insensibilità alle variazioni di flusso e temperatura risposta a tutti i tipi di composti RIVELATORE

11. HPLC LINEARITA’ accuratezza del’analisi quantitativa RUMORE perturbazione della linea di base massima sensibilità concentrazione minima rivelabile dell’analita SENSIBILITA’ ASSOLUTA valore minimo della grandezza misurata che determina la deflessione a fondo scala del registratore, ad un dato valore del rumore di fondo  caratteristiche costruttive RELATIVA minima concentrazione di soluto eluito che può essere chiaramente distinta dal rumore SEGNALE/RUMORE = 2  PICCO IDENTIFICABILE RIVELATORE

12. HPLC RIVELATORI

13. HPLC l’indice di rifrazione del solvente cambia in presenza di un soluto Rivelatore a indice di rifrazione • stabile • risente delle variazioni di flusso, di pressione e di temperatura   • non distruttivo • non è utilizzabile in gradiente • Analisi di carboidrati  senza particolari cromofori  non contengono ioni  non danno fluorescenza • Alcoli alifatici • Prodotti di idrolisi degli amidi

14. HPLC assorbimento dell’analita nella regione UV-Vis solventi adeguati insensibile al flusso poco sensibile a T purezza = rapporto di assorbimento a l diverse • identificazione dei soluti • l tipiche Rivelatore UV • stabile • risente delle variazioni di flusso, di pressione e di temperatura   • non distruttivo • non è utilizzabile in gradiente • buona linearità • può essere usato con flussi pulsati (gradiente)  A l fissa (254 nm - lampada al mercurio - più sensibile, meno versatile)  A l variabile (190-350 nm - lampada al deuterio - continuo o stopped) •  A diode array (190-350 nm - lampade a deuterio o xeno • spettro UV in continuo dell’eluato)

15. HPLC composti o derivati fluorescenti più sensibile, meno versatile di solito abbinato ad UV o indice di rifrazione Rivelatore di fluorescenza  l scelta in base allo spettro di fluorescenza dell’analita  usato in medicina legale perché estremamente sensibile

16. HPLC - TECNICHE DI SEPARAZIONE E FASI STABILITA’ TERMICA INERZIA VERSO SOLVENTI & SOLUTI isolato (più attivo) legato silossano (idrofobico) silanolo disattivato con acqua FASE STAZIONARIA Silice non derivatizzata FASE DIRETTA • stabilità in un intervallo limitato di pH • variazione dell’acidità da tipo a tipo  ritenzione di soluti acidi e basici • adsorbimento irreversibile di analiti polari  silici funzionalizzate • controllo stretto delle quantità di H2O per avere maggiore riproducibilità • riequilibrio lento al cambiamento della fase mobile

17. HPLC - TECNICHE DI SEPARAZIONE E FASI +  organosilano silice fase inversa X3-nSiRR’n 1 ≤ n ≤ 3 R = n-alchile, fenile, cianoalchile R’ = metile X = gruppo uscente: cloro, alcossi, dialchilammino

18. HPLC - TECNICHE DI SEPARAZIONE E FASI legami a idrogeno interazioni dipolo-dipolo con composti polari gruppi silanolo: debolmente acidi perdita di risoluzione endcapping idrolisi dei legami silossanici a bassi pH fasi polimeriche (polimeri stirene-divinilbenzene) 2 < stabilità < pH 8 dissoluzione della silice a pH elevati = seconda funzionalizzazione con organosilani con gruppi più piccoli (TMSCl, HMDS) SVANTAGGI

19. HPLC - TECNICHE DI SEPARAZIONE E FASI IDROFOBICO SOLVOFOBICO Repulsione della fase acquosa mobile piuttosto che interazione con la fase fissa meccanismo di ritenzione Contengono una maggior proporzione di solvente organico Fasi mobili non polari Fasi forti Inducono il soluto a legarsi alla fase stazionaria tempi di ritenzione lunghi Fasi mobili polari Fasi deboli Influiscono sui tempi di ritenzione, perché le molecole di soluto ionizzate interagiscono più fortemente con la fase mobile e vengono eluite prima. Variazioni di Ph

20. HPLC SEPARATIVO velocità risoluzione velocità risoluzione diametro e lunghezza della colonna industriale capacità di caricamento dimensioni delle particelle quantità di componente isolata per unità di tempo densità di impaccamento SCALA ANALITICA 1-10 mg dimensioni della colonna velocità di flusso cromatografia analitica cromatografia preparativa dipende da dipende da SCALA SEMIPREPARATIVA 100-200 mg SCALA PREPARATIVA 0.5-1 g  1 Kg

21. HPLC COLONNE

22. HPLC SEPARATIVO COSTANZA DEI VOLUMI DI RITENZIONE il soluto si distribuisce lungo la fase stazionaria la banda si allarga effetti di dispersione campioni poco solubili volumi iniettati troppo alti sovraccaricamento della colonna campioni solubili campioni troppo concentrati precipitazioni in colonna campione poco solubile nella fase mobile DI VOLUME sovraccaricamento della colonna DI MASSA