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基因工程实验

基因工程实验. 实验一 根癌农杆菌 Ti 质粒介导基因转化 实验二 转基因植物表型及 GUS 表达活性分析 实验三 CTAB 法制备植物基因组 DNA 实验四 大肠杆菌质粒 DNA 的提取 实验五 PCR 法体外扩增 DNA 实验六 大肠杆菌感受态细胞的制备 实验七 DNA 连接及连接产物的转化 实验八 λ 噬菌体文库的铺平板培养. 实验一. 根癌农杆菌 Ti 质粒介导基因转化. 实验目的. 植物生物技术的核心是转基因技术，即将外源ＤＮＡ通过基因工程手段引入植物细胞，并使之与植物的基因组整合，从而使转基因能够稳定地遗传下去。

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基因工程实验

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  1. 基因工程实验

  2. 实验一 根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化 • 实验二 转基因植物表型及 GUS表达活性分析 • 实验三 CTAB法制备植物基因组DNA • 实验四 大肠杆菌质粒DNA的提取 • 实验五 PCR法体外扩增DNA • 实验六 大肠杆菌感受态细胞的制备 • 实验七 DNA连接及连接产物的转化 • 实验八 λ噬菌体文库的铺平板培养

  3. 实验一 根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化

  4. 实验目的 植物生物技术的核心是转基因技术，即将外源ＤＮＡ通过基因工程手段引入植物细胞，并使之与植物的基因组整合，从而使转基因能够稳定地遗传下去。 　　 遗传转化一般是要转基因在植物中表达，或大量表达，利用遗传转化获得想要的植物性状，以达到分子育种的目的。

  5. 实验原理 根癌农杆菌携带的Ti质粒T－DNA区片断能在诱导物的作用下可以进入植物细胞，整合到植物核基因组中。由于植物细胞的全能性，在无性繁殖的过程中，外源的基因片断（T-DNA片断）一般随着植物细胞的增值而在每个细胞的核基因组中保留，最终可以得到完整的转基因植株。

  6. 根癌农杆菌的遗传宿主及内共生原理

  7. T-DNA进入植物核基因组的作用过程 １、损伤的植物细胞产生植物酚类作为农杆菌的侵染信号； ２、这些化学信号通过农杆菌的细胞膜，活化Ti质粒Vir 区基因； ３、Vir 区基因活化，作用于T-DNA的加工及其转移； ４、T-DNA进入植物细胞后整合到核DNA上； ５、T-DNA在植物细胞中表达产生冠瘿碱。

  8. 实验内容 1、根癌农杆菌的培养、纯化，工程菌侵染悬浮 液的制备 2、外植体的预培养 3、农杆菌侵染外植体 4、外植体与农杆菌的共培养 5、外植体脱菌及选择培养 6、不定芽的再生 7、不定芽诱导生根、移栽

  9. 实验结果分析 １、筛选4 d后，观察材料的污染情况。 ２、筛选21 d后，观察材料的愈伤诱导及 芽诱导情况，并统计出芽率。 出芽率=接种外植体数/诱导出芽外植体数

  10. 转基因植物表型及 GUS（β-葡萄糖醛酸糖苷酶）表达活性分析 实验二

  11. 一、转基因植物表型 经过转基因的植物很多在表型上与非转基因的有很大的不同。

  12. 左为对照，右为转ipt基因水稻植株 右为对照，左为转ipt基因水稻植株

  13. 左 转ipt基因油菜 中转HSP基因 右 对照 左 转KN1基因油菜植株 右 对照植株

  14. 图中左为转ipt基因矮牵牛植株，右为非转基因对照植株图中左为转ipt基因矮牵牛植株，右为非转基因对照植株

  15. 二、GUS表达活性分析 常用的检测转基因植物的方法之一。 GUS基因是个普遍应用的报告基因，有很多方法检测GUS的活性，包括组织化学法、色谱法、荧光法等。

  16. 植物切片GUS组织化学定位分析是分辨组织的不同细胞个体和不同的细胞类型基因（GUS）表达差异的一种有效方法，在植物遗传转化中应用较多。植物切片GUS组织化学定位分析是分辨组织的不同细胞个体和不同的细胞类型基因（GUS）表达差异的一种有效方法，在植物遗传转化中应用较多。 有很多因素干扰分析，如溶液中不能有氧化催化物（铁氰化钾/铁氰化物）、过氧化物酶等存在

  17. 转基因植物的GUS染色

  18. 实验步骤 1、将转基因矮牵牛叶片放入针管中， 入GUS染液1 ml，用力抽针空两次。 2、37℃培养箱放置过夜。 3、倒掉染液，依次加入各1ml 5%、20％、50％、70％乙醇浸泡5min，于95%乙醇中浸泡，直至完全脱去绿色。

  19. 实验要求 1、转基因植株表型观察。 2、转基因植株的GUS染色分析

  20. 实验三 CTAB法制备植物基因组DNA 一、实验原理： 基因组DNA存在于细胞核中，先将新鲜的植物叶片在液氮中研磨，破碎其组织、细胞，使DNA释放出来。然后加入CTAB提取缓冲液，将DNA充分溶解于提取缓冲液中。再通过苯酚、氯仿-异戊醇等有机溶剂抽提去除蛋白质，最终通过乙醇沉淀将DNA析出，溶解于TE缓冲液中。

  21. 二、实验材料： 1.植物材料 水稻幼嫩叶片 2.试剂 CTAB提取缓冲液（1.5% CTAB ，100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl） 氯仿/异戊醇(24:1)、TE缓冲液、无水乙醇、70%乙醇、巯基乙醇、NaAc (pH 5.2 3mol/L)

  22. 三、实验仪器 凝胶成像系统 陶瓷研钵 • 移液枪、 • 台式高速离心机 • 水浴锅 • 陶瓷研钵 • 1.5ml离心管 • 凝胶成像系统 台式高速离心机 移液枪 1.5ml离心管 水浴锅

  23. 四、实验步骤： 1. 在1.5ml离心管中加入0.7ml 60℃水浴预热的提取缓冲液CTAB。 2. 取0.4g水稻叶片剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀,加入1.6l巯基乙醇, 60℃水浴保温40分钟(时间长,DNA产量高), 每5分钟摇动一次。 3. 加入0.3ml饱和酚,混匀,室温下放置2分钟。 4. 加入0.3ml氯仿/戊醇（24：1）溶液, 颠倒充分混匀，室温下静置2min, 使水相和有机相分层。 5. 室温下10000rpm离心5分钟。 6. 仔细移取上清液至另一1.5ml离心管,加入等体积氯仿混匀放置2分钟。室温下10000rpm离心5分钟。 7. 取上清液到1.5ml 离心管中，加入1/10体积NaAc，加2倍体积无水乙醇（－20℃预冷），在20℃下，冷冻1小时。室温下10000rpm离心5分钟,用抽干机抽干。 8．加入50ul TE溶液溶解沉淀储存。

  24. 5、实验结果检测： 提取的DNA采用琼脂糖凝胶电泳进行检测。 1．称取 0.7g 琼脂糖倒入三角瓶中，加入 1 × TAE 缓冲液 100ml ，置微波炉或水浴加热至完全熔化，取出摇匀，稍冷却后加 1 μl EB 染色液，摇匀。 2.灌胶 (1) 取洁净的电泳内槽 ( 又称托盘 ) ，用橡皮膏或透明胶带将内槽的两端边缘封好 ( 一定要封严，不能留缝隙 ) 。 (2) 将内槽放置于一水平台面，并插好所需齿数和厚度的样品梳子。 (3) 将冷却至 60 ℃左右的琼脂糖凝胶液，缓慢倒入内槽，直至所需厚度，注意不要形成气泡，特别是梳子下，如有气泡可用牙签挑破。 (4) 待胶凝固后，小心取出梳子，撕去橡皮膏或透明胶带，将带凝胶的内槽放入电泳槽中，注意凝胶点样端要靠近负极。 (5) 加入 1 × TAE 缓冲液至电泳槽，缓冲液刚没过凝胶表面即可。 3．加样 剪取适当大小的透明胶带 ，取 6 ×上样缓冲液 1 μ l 点于胶带上数点。取 5 μ l 植物基因组DNA与上样缓冲液混匀。将其分别加入凝胶的点样孔 ( 记录点样顺序及点样量 ) 。 4．电泳 接通电源槽与电泳仪的电源 ( 检查正负极， DNA 片段是从负极向正极移动 ) 。 DNA 的迁移率与电压成正比，电压不超过 5V/cm 凝胶长度。当溴酚蓝染料移动至凝胶前沿1～2cm 处，切断电源，停止电泳。

  25. 琼脂糖凝胶电泳技术 1 2 3 4 7 5 8 6 7 9 11 12 10

  26. 实验结果

  27. 实验四 大肠杆菌质粒DNA的提取 一、实验原理 • SDS是一种阴离子表面活性剂，既可使细菌细胞裂解，又可使一些蛋白质变性，因此用SDS处理细菌，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA从细胞中释放出来。释放出来的DNA在强碱性条件下发生变性。再用酸性乙酸钾来中和，使溶液处于中性，离心后，质粒DNA将在上清中，而细胞碎片一起沉淀至离心管底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。

  28. 1.实验材料 含带有ipt基因质粒的大肠杆菌 2.实验设备 离心机、涡旋振荡器、37℃水浴锅、电泳槽 3.实验试剂 Solution1:50mmol/L 葡萄糖，25mmol/LTris·Cl(pH8.0),10mmol/L EDTA(pH8.0)高温高压灭菌15min,4℃保存 Solution2:0.2mol/LNaOH,1% SDS Solution3:0.2mol/L KAC 60mol/L,冰乙酸 11.5ml,ddH2O 28.5ml(pH4.8) Rnase: 100mg Rnase粉剂，溶于10ml 10mmol/L Tris·Cl(pH7.5), 15mmol/L NaCl缓冲液中，水浴煮沸15min,冷却，－20℃保 存。

  29. 二、实验操作 1.菌株准备： a．将1.5ml细菌培养物加入微量离心管 中，用微量离心机于室温以5000rpm离心5min，倒掉上清液，再加入1.5ml细菌培养物，离心，合并两次所得。 b．吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。

  30. 2、碱裂解： • 将细菌沉淀重悬于150l的溶液Ⅰ中，剧烈震荡。须确使细菌沉淀在溶液Ⅰ中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触，在振荡器上进心振荡，可使沉淀迅速分散。 • 加150l新配制的溶液Ⅱ。盖紧管口，快速颠倒离心管数次，充分混合，切忌振荡。（溶液Ⅱ0.4mol/L NaOH与2% SDS等体积混合，则NaOH 终浓度为0.2mol/L，SDS终浓度为1%）。放于冰上直到溶液变粘稠、清亮，及开盖时有拉丝现象。时间不宜超过2分钟，否则DNA易降解。 • 加250l的溶液Ⅲ（溶液Ⅲ要在冰上预冷）。盖紧管口，颠倒离心管数次，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上10分钟。 • 用微量离心机于室温以13,000rpm离心10-15分钟，将上清液转移到另一离心管中。 • 加入2倍体积的无水乙醇（约700l），颠倒离心管数次以混合，冰箱放置（-20°C）20min。 • 13000rpm离心10-15min，弃上清液。 • 用1ml 70%乙醇于室温洗涤DNA沉淀。只需浸泡静置10分钟，不用将DNA沉淀重新悬浮。 • 去掉上清液，倒扣于吸水纸上几分钟，在空气中使沉淀干燥或真空抽干，干燥的标志为白色沉淀变为半透明或透明。 用18l TE溶解核酸，加2l RNase（100g/ml），使RNA酶终浓度为 20g/mg，振荡，37℃度保温40分钟。

  31. 实验五 PCR法体外扩增DNA 一、实验原理： • 双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入耐热DNA聚合同酶-Taq酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 • 标准的PCR过程分为三步：1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA。2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。PCR结果可通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。

  32. PCR扩增原理图

  33. 二、实验材料 1. Taq酶, 10×Buffer, dNTP, ddH2O, 引物, 质粒DNA 2.实验仪器 PCR仪, 移液器，离心机 ABI公司9700型PCR仪

  34. 三、实验步骤： 在0.5 ml离心管中按如下体积加入各反应物： • ddH2O 14 ml • 10×buffer(含Mg2+) 2 ml • dNTP（2.5mM）1.2 ml • Primer1（10 pmol/ml）0.8 ml • Primer2（10 pmol/ml）0.8 ml • 质粒DNA（约100 ng/ml）1.0ml • Taq酶（5 U/ml）0.2 ml • 总体积 20 ml

  35. 充分混匀后将离心管放于PCR仪上,按下列程序进行反应：充分混匀后将离心管放于PCR仪上,按下列程序进行反应： • 94℃ 5 min • 94℃ 30 s • 55℃ 30s 35个循环 • 72℃ 30s • 72℃ 8 min • 4℃ ∞

  36. 四、实验结果：

  37. 实验六 大肠杆菌感受态细胞的制备 一、实验原理 感受态指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态. 它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。 Ca2+可使细胞膜通透性增加，大大促进转化的作用。 细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。

  38. 实验材料 大肠杆菌DH5α菌株 实验仪器 制冰机，37℃摇床， 高速冷冻离心机，超净工作台

  39. 实验步骤 • 1. 用牙签挑取少许宿主菌保藏液稀释划线于LB固体培养基上，37℃下隔夜培养。 • 2. 挑取单菌落接种于5 ml LB液体培养基中，37℃下隔夜培养。 • 3. 按1%的接种量将大肠杆菌菌液接种于30 ml LB培养基中。 • 4. 在37℃的水浴摇床中培养至OD600接近0.5。 • 5. 用1只1.5ml无菌Eppendorf管,取上述菌液2次共3ml,4℃，5000 rpm 离心1分钟收获菌体。 • 6. 上述得到的菌体沉淀用600ul的0.1M CaCl2（冰冻）悬浮30分钟，4℃，5000 rpm离心10分钟。 • 7. 弃上清,将沉淀用100ul的0.1M CaCl2（冰冻）重新悬浮并转入无菌Eppendorf管中,备用。

  40. 实验结果分析 • 制备好的感受态细胞，于-80℃冰箱中冻存，并应用于进一步的连接及转化。

  41. 注意事项 • 1.实验中所有酶均需于冰浴溶化后再使用 • 2.使用离心机前，要严格保证离心物品充分平衡，以免造成离心机损伤。

  42. 实验原理 实验七 DNA连接及连接产物的转化 • T4噬菌体DNA连接酶可在体外使外源DNA片段和线状质粒载体之间形成新的3'，5'磷酸二酯键。实验所用载体为TakaRa公司T载体pMD18-T Simple Vector，PCR胶回收产物游离T末端与载体的游离A末端可互补配对并在连接酶作用下连接形成重组质粒。 • 转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。本实验中连接形成的重组质粒具有Amp抗性，转化细胞可在相应培养基中形成菌落。

  43. 实验材料 • PCR胶回收产物，pMD18-T Simple Vector，已制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞 实验仪器 • PCR仪，制冰机，42℃水浴锅，37℃摇床

  44. 实验步骤 • （一）PCR产物的连接 • 1. 将PCR扩增产物，用琼脂糖凝胶电泳分离并回收溶解于TE缓冲液中。 • 2. 载体DNA片段取1ul，胶回收DNA片段取1ul，充分混匀。 • 3. 再依次加入：ddH2O 3ul, ligation solution I 5ul，总计体积为10ul。 • 4. 置于16℃连接30min，也可过夜，备用。

  45. （二）连接产物转化大肠杆菌 • 1. 取一管已制备好的大肠杆菌感受态细胞置于冰水浴中溶解。 • 2. 吸取100ul感受态细胞悬浮液至无菌Eppendorf管中，加入2ul 质粒DNA溶液（此处用实验五的连接液），轻轻混匀，在冰水浴中放置20分钟。 • 3. 42℃水浴中脉冲1.5-2分钟，快速转移至冰水浴中2分钟，加入800ul LB培养基，37℃水浴摇床培养1小时。 • 4. 吸取100ul已转化的感受态细胞涂布于LB抗性平板。 • 5. 37℃下倒置培养12-16小时，挑选单菌落划线扩增培养。

  46. 对照组 • 对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 • 对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生菌落。

  47. 实验结果分析 • 本实验中连接形成的重组质粒具有Amp抗性，转化细胞可在相应培养基中形成菌落。转化大肠杆菌铺板后24h观察抗性菌落。 • 由于没有抗生素的筛选对照组2产生大量菌落；而对照组1则没有产生菌落。

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