第一讲 病毒与传染病基础

1. 第一讲 病毒与传染病基础 第一章 抗血清的制备

2. 基本原理 • 将具有完全抗原性的物质注入健康的动物机体后，动物体内便会产生相应的抗体。待动物血清中存在大量抗体时，采集动物血液，分离析出血清，便得到所需要的抗血清（免疫血清或抗体）。 • 优质的高效价抗血清可用于教学、科研以及疾病的诊断和治疗。

3. 一、抗原和抗体 1、抗原（Antigen，Ag） 抗原是能诱导机体产生抗体和细胞免疫应答，并能与抗体和致敏淋巴细胞在体内外发生特异结合反应的物质。 （1）抗原的特性 抗原在体内激活免疫系统，使其产生抗体和特异效应细胞的特性。 A.免疫原性（immunogenicity）： 或称反应原性（reactinogenicity），是指抗原能与相对应的免疫应答产物(抗体及致敏淋巴细胞)发生特异结合和反应的能力。 B.免疫反应性（immunoreactivity）： 完全抗原（complete antigen）： 具有免疫原性和反应原性的抗原 不完全抗原（incomplete antigen）： 只有反应原性而没有免疫原性的抗原，或称半抗原（hapten）

4. 抗原决定簇（antign determinant） 或称表位（epitope），是指抗原物质上能够刺激淋巴细胞产生应答并与其产物特异反应的化学基团。它是抗原特异性的物质基础。抗原所携抗原决定簇的数目称为抗原价，一般抗原是多价的。

5. 2、抗体（antibody，Ab） 又称免疫球蛋白（immunoglobulin， Ig），是机体在抗原物质刺激下所形成的一类能与抗原特异结合的血清活性成分，是机体免疫细胞被抗原激活后，由B细胞分化成熟的浆细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 抗体是由B细胞合成并分泌的。

6. 二、免疫应答过程 1、免疫应答的基本过程 感应阶段 反应阶段 效应阶段 （1）感应阶段 机体接受抗原刺激的阶段 抗原 巨噬细胞 T细胞 细胞免疫 B细胞 体液免疫 免疫活性细胞表面有抗原受体，所以能够识别抗原。每个淋巴细胞表面只有一种抗原受体，只能识别一种抗原，当抗原和受体结合后，抗原刺激淋巴细胞增殖、分化而产生免疫应答。

7. （2）反应阶段 淋巴细胞识别抗原后被活化进行增殖、分化 • T细胞：被特异性抗原激活的T细胞转化为淋巴母细胞，再增殖、分化，成 为有免疫效应的致敏淋巴细胞。 • B细胞：被特异性抗原激活的B细胞被活化后，转化为浆母细胞，再增殖、分化为浆细胞，分泌抗体。 受抗原刺激的淋巴细胞，在分化过程中，还有一部分细胞在中途停顿下来，不再增殖分化，成为记忆细胞，在体内能较长时间存在。当再次受到同种抗原刺激时，能迅速分化增殖成大量致敏淋巴细胞和浆细胞，分别产生大量淋巴因子及抗体。

9. （3）效应阶段 抗原成为被打击的对象。 • B细胞介导的体液免疫： 体液中的抗体与相应的抗原进行特异性结合，发挥免疫效应的过程。 • 与抗原特异结合 • 激活补体 • 结合细胞 • 通过胎盘 • T细胞介导的细胞免疫： 致敏淋巴细胞通过与相应的抗原接触直接杀伤病原靶细胞，或释放多种可溶性的生物活性物质（淋巴因子），发挥免疫效应。

10. 三、免疫血清制备过程中的一些关键因素

11. 1.抗原的设计及和制备 • 一个良好的抗原需要具备如下条件： • （1）分子量足够大 • （2）外源性强 • （3）结构尽量复杂 • （4）可降解性好

12. 常用抗原的种类及制备方式： • （1） 纯化的天然蛋白质：e.g.二抗的制备 • （2）纯化的重组蛋白：标签抗体的去除 • （3）人工合成多肽： 相似性高的蛋白家族 • （4）小分子物质：小于1kD，偶联载体 • （5）组织、全细胞或细胞组分：在不确定所需抗原成分时 • 总体来说，不管何种形式的抗原，其纯度越高越好，且不能有太强毒性。

13. 2. 动物的选择 • 常见的可以用来制备抗体的动物有：小鼠（Mouse）、大鼠(Rat)、 豚鼠(Guinea pig)、仓鼠(Hamster)、兔(Rabbit)、绵羊(Sheep)、山羊(Goat)、马(Horse)、驴(Donkey)、奶牛 (Cow），还有的还用鸡或者鸭的。

14. 动物选择需要把握两个要点： • （1）保障良好的免疫效果。需注意免疫动物和抗原来源物种之间的亲缘关系。 • （2）产量问题。血清用量限制。 • 需要遵守相应的动物实验的法律法规，具有相应资质，实验动物需选择特定品系，并购自专门的机构，以保证结果的稳定性。

15. 3. 免疫佐剂 • 佐剂(Adjuvant)，又称免疫调节剂或免疫增强剂，是指先于抗原或与抗原混合后与抗原同时注入动物体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，发挥辅助作用，而本身并不引起机体免疫应答的一类物质。

16. 免疫佐剂主要有两个作用： • （1）刺激机体引起免疫反应 • （2）将抗原包起来延缓释放，起到相当于多次刺激的效果 • 可以用来制备抗体的免疫佐剂主要有： • 铝盐 • 油乳 • 脂质体 • CpG • 细胞因子 • 经过处理的微生物或其代谢物

17. 目前应用得比较广泛的商品化佐剂主要有三种：弗氏佐剂（Freund‘s Adjuvant）、Ribi Adjuvant、Titermax。 • 弗氏佐剂： • 弗氏完全佐剂（FCA）：石蜡油、羊毛脂以及结核分枝杆菌的细胞壁成分组成。细胞免疫+体液免疫 • 弗氏不完全佐剂（FIA）：不含结核分枝杆菌成分，其余与FCA相同。仅激发体液免疫。 • 一般首次免疫采用FCA，加强免疫采用FIA。 • 弗氏佐剂需与抗原完全乳化，易引起局部肉芽肿或无菌性脓肿。

18. 4、实验室小量乳化方法 • （1） 研磨法 • 将弗氏佐剂加入到研钵中，再滴加抗原，每加一滴应研磨至小滴消失，滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。 • 适于制备多量的佐剂抗原 • 缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。

19. （2） 注射器混合法 • 将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，以软管连接两注射器，交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。 • 优点：无菌操作，节省抗原或佐剂 • 缺点：不易乳化，耗时。

20. （3） 超声快速乳化法 • 利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。 • 将抗原和佐剂按所需量加入一离心管中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下 0.5cm，离瓶底0.5cm左右，以免打碎离心管。 • 每次乳化 10～15s，然后置冰箱l min左右。反复乳化3～4次即可完全乳化。管内残余量800r/min离心5～10min收集。 • 优点：简单、快速、节省材料。

21. （4）涡旋法 • 将抗原和佐剂放在离心管里，先用枪反复吹打，然后放在涡旋仪上反复涡旋。 • 耗时费力。

22. （5） 乳化抗原判定 • 对于弗氏佐剂这类油包水结构的佐剂来说，判断乳化是否充分，可以取一滴乳化过的液滴滴在一杯清水里，看看此液滴是否分散，如果不分散则表明乳化完全，否则还要接着乳化。

23. 5、免疫剂量选择 • 抗原剂量的选定应考虑： • 抗原性强弱、分子量大小、免疫时间 • 抗原性弱，需求量多，时间间隔长，剂量可适当加大。 • 大动物抗原剂量（以蛋白抗原为准）约0.5～1mg/只，小动物约0.1～0.6mg/只。 • 剂量不宜过大： • 浪费抗原 • 免疫耐受

24. 6、常用免疫注射方式（免疫途径 ） • 常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。 • 一般采用多点注射方法。 • 常在足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。 • 皮内免疫易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。

25. 免疫途径的几点说明 • 大动物一般不用腹腔注射 • 颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射 • 抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10～100微克抗原即可获得较好的免疫效果。 • 皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入。

26. 7、免疫间隔时间 • 免疫间隔时间也是重要因素，特别是首次与第二次之间更应注意。 • 第一次免疫后，因动物机体正处于识别抗原和B细胞增殖阶段，如很快接着第二次注入抗原，极易造成免疫抑制。 • 一般以间隔10～20天为好。二次以后每次的间隔一般为7～10天，不能太长，以防刺激变弱，抗体效价不高。 • 半抗原的免疫间隔较长，达30～50天。因为半抗原是小分子，难以刺激机体发生免疫反应。

27. 四、关于本次实验 • 1. 抗原 • APP灭活培养液（颗粒性抗原＋可溶性抗原），免疫家兔； • 鸡红血球（颗粒性抗原），免疫小鼠。 • 2. 佐剂（仅抗APP抗体制备使用） • 弗氏完全佐剂：首次免疫 • 弗氏不完全佐剂：加强免疫 • 3. 乳化方式： • 超声法：将1 ml抗原与1 ml弗氏佐剂混合摇匀，将超声破碎仪小号探头浸入液面下，30kH，15s，置冰上1min，重复3~4次至完全乳化。

28. 4. 免疫程序 • 3.23 首免 • 4.6第二次免疫 • 4.20第三次免疫 • 5.11放血，收集血清 • 5. 家兔免疫方式（注射部位消毒）： • 在背部皮下注射6～8点，每点0.1～0.2ml，也可肌肉内或皮内注射； • 6. 小鼠免疫方式： • 腹腔注射，总量不超过0.5ml/只。

29. 五、动物采血法 • 末次免疫3～5天后，小量采血，检测抗血清效价，如果合格，应在末次免疫后5～7天及时大量采血，否则抗体将会下降。因故未及时取血，则应补充免疫一次（肌肉、腹腔或静脉内注射，不加佐剂），过5～7天取血。 • 小量采血方法： • 小鼠：断尾取血（负压采血），约0.2 ml。 • 家兔：耳静脉采血，约2 ml。

30. 大量采血： • 小鼠：眼球摘除法，一般不超过2 ml； • 家兔：颈动脉放血，约100ml。 • 具体内容下一章节再讲。

31. 六、其他事项 • 1. 参考书目：《生物化学实验教程》、《微生物学实验指导》、《免疫学与免疫学实验》 • 2. 分组：同其他实验课堂 • 3. 动物领用：班长负责安排 • 3. 注意安全：正确保定方式，防咬伤、抓伤 • 4. 保持卫生

32. 抓取和固定家兔方法

33. 抓取小鼠及腹腔注射方法

34. 4. 佐剂与抗原的乳化

39. 三、佐剂 佐剂(Adjuvant)，又称免疫调节剂或免疫增强剂，是指先于抗原或与抗原混合后与抗原同时注入动物体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，发挥辅助作用，而本身并不引起机体免疫应答的一类物质。 • 盐类佐剂 • 油乳佐剂 • 脂质体 • 微生物及微生物来源佐剂 • 植物来源佐剂 • 细胞因子佐剂

40. 1. 盐类佐剂 • 盐类佐剂以铝盐佐剂最常用。1926年开始应用，直至今日它仍是唯一被FDA批准使用的人用疫苗佐剂。 • 铝佐剂与抗原形成复合物，注射后在局部形成抗原储存库，使抗原缓慢释放，较长时间刺激免疫细胞，增强机体的体液免疫反应。 • 铝盐佐剂的不足之处：①只能增强体液免疫，不能增强细胞免疫。②会诱导产生IgE抗体，增加发生超敏反应的危险。③不能冻干，需在低温条件保存运输。④制备的凝胶批次之间差异很大。即难控制质量，又难对佐剂效果作出准确评价。

41. 2. 油类佐剂 • 油乳佐剂中含有油和乳化剂。它的作用机制是抗原被油相形物质所包被，形成贮存库而缓慢释放，刺激免疫细胞产生抗体。油乳佐剂主要有弗氏佐剂、佐剂-65、白油Span佐剂、MF-59等。 • 弗氏佐剂分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂两种。FIA是由低黏度的矿物油及乳化剂组成的一种贮藏性佐剂；FCA是在不完全佐剂的基础上加一定量的分枝杆菌而成。FCA是细胞免疫的强刺激剂，而FIA则仅能刺激体液免疫。 • 弗氏佐剂主要不足之处：可引起局部肉芽肿和无菌性脓肿；使用矿物油可能有致癌问题；稳定性差，难以长期保存；有对结核菌素致敏等毒副作用，故仅限用于兽用。

42. 3. 脂质体 • 脂质体是单层磷脂或由数层可溶性物质隔离开的，呈同心圆状排列的，连续多层磷脂所组成的脂质小囊，内含水相空间，能将抗原传递给合适的免疫细胞，促进抗原的定向作用。 • 脂质体作为佐剂存在的主要问题是稳定性：(1)所用材料的脂肪酸有不同程度的双链，贮存时会随时间而逐渐氧化，产生溶血磷脂。(2)小脂质体倾向于相互融合成大脂质体，在融合过程中可导致包入的抗原释放。

43. 4. 微生物来源佐剂 • 具有佐剂活性的微生物有分枝杆菌及其成分、革兰氏阴性菌类及其产物、革兰氏阳性菌。此外，霍乱毒素(CT)、CpG DNA等也有佐剂作用。 • 微生物佐剂主要是细胞壁上的肽聚糖起作用，如胞壁酰二肽(MDP)、胞壁酰三肽(MTP)、蜡质D、海藻糖双霉菌酸脂(TDN)等。 • 其中对MDP研究较多，MDP是从分枝杆菌细胞壁上提取的一种免疫活性成分，能刺激产生IgA。MDP可刺激T细胞的增殖，还可以活化非特异性免疫，诱导机体产生细胞因子。

44. 5. 植物来源佐剂 • 从南美的一种皂树中提取出来的皂素成分Quil A ，具有增强免疫反应的能力。从Quil A分离到的QS-21，可以刺激产生更多的抗原特异的抗体分泌细胞和增强细胞毒T淋巴细胞的杀伤作用。 • 此外，中草药如人参、当归、芦荟及复方柴术散等均有佐剂作用。

45. 6. 细胞因子 • 细胞因子在免疫应答的产生和调节中具有重要作用，可作为免疫佐剂增强疫苗的免疫效果。 • 具有免疫佐剂效应的细胞因子主要包括淋巴因子(如IL-2)、单核细胞因子(如IL-l、肿瘤坏死因子TNF)和干扰素(包括α-和γ-干扰素)等。 • 细胞因子的免疫佐剂效应，主要表现为：( 1)增强机体的抗感染能力；(2)增强疫苗的保护效应。

46. 弗氏佐剂 • 1.弗氏不完全佐剂 • 油剂：石蜡油5份 • 乳化剂：羊毛脂1份 • 2.弗氏完全佐剂 • 在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌(终浓度为10～20mg/ml) 。 • 将弗氏佐剂与抗原按体积 1:1 混合乳化后(油包水)注入动物。 • 一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。