Плазмиды

1. Клонирование ДНК Плазмиды Плазмида – внехромосомный генетический элемент встречающийся во множестве видов бактерий. П. – это двухцепочечные замкнутые кольцевые молекулы ДНК размером от 1 до 200 тысяч пар оснований.

2. ген 1 Плазмиды содержат гены: 1. Устойчивости к антибиотикам; 2. Синтеза антибиотиков; 3. Расщепления сложных органических соединений; 4. Образования колицинов (летальные изменения мембран); 5. Образования энтеротоксинов; 6. Образования ферментов рестрикции и модификации (рестриктазы+метилазы). ген n

3. Рестриктазы (эндонуклеазы рестрикции) Р. – ферменты вносящие в ДНК двуцепочечный разрыв с образованием выступающих ‘липких’ концов. Разрыв вносится по определенным последовательностям-палиндромам. HindIII 5’-AAGCTT-3’Haemophilus influenzae Rd 3’-TTCGAA-5’ геном закончен в 1995 г. EcoRIGAATTCEscherichia coli BamHI GGATCCBacillus amyloliquefaciens H PstI CTGCAGProvidencia stuartii

4. Метилазы М. – присоединяют метильную группу к ДНК, т.е. модифицируют ее, причем по определенным последовательностям. Модифицированная ДНК не гидролизуется рестриктазами. Таким образом бактерия защищает свою ДНК от собственных рестриктаз, но не от чужих, т.к. чужие рестриктазы могут узнавать неметилированные последовательности.

5. Ar Ori Клонирование ДНК ген устойчивости к антибиотику A Последовательнсти, распознаваемые какой-то эндонуклеазой рестрикции(сайты), например EcoRI Ar лигаза EcoRI Ген Х Origin репликации Ori Сайты для EcoRI Ген Х Ген Х Фрагмент ДНК, содержащий ген, который мы собираемся клонировать Гидролиз и лигирование (сшивка) ДНК

6. Клонирование ДНК Плазмиды с геном Х Электрический разряд ~2000 V, 5 ms Чашка Петри с селективной средой: агар+антибиотик А E.coli Размножаются только те бактерии, которые содержат плазмиду с геном устойчивости к антибиотику Трансформация E. coli, селекция клонов