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分子标记技术. 随着分子生物学技术在各个领域的发展，产生另一类重要的遗传标记，即以直接检测 DNA 分子碱基序列变异为基础的分子标记。
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随着分子生物学技术在各个领域的发展，产生另一类重要的遗传标记，即以直接检测DNA分子碱基序列变异为基础的分子标记。随着分子生物学技术在各个领域的发展，产生另一类重要的遗传标记，即以直接检测DNA分子碱基序列变异为基础的分子标记。 依据分子生物学检测技术，可分为两类：一是以分子杂交技术为核心的分子标记（如RFLP和以各种重复序列克隆作探针的分析方法）；二是以PCR技术为核心的分子标记，它又可分为单引物PCR标记和双引物PCR标记。前者如随机扩增多态DNA（random amplified Polymorphic DNA，RAPD)和DNA扩增指纹分析（DNA amplification finger,DAF);后者如扩增片段长度多态性（amplification fragment length polymorphism,AFLP)、简单序列重复（simple sequence repeat,SSR）和序列标签位点（sequence-tagged site,STS)。
各类标记的基本原理 • （一）RFLP标记 限制性酶切片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP),是用限制性内切酶处理不同个体基因组DNA所产生的大分子片段的大小的多样性。RFLP多态的原因是点突变导致的限制性位点改变和基因顺序重排（包括大基因片段的缺失和插入），该技术把提取的DNA用限制性内切酶切割成不同的、大小不等的DNA分子片段，经电泳分离，转移到尼龙或纤维素薄膜上，再与一个已知的DNA分子探针，经同位素标记，进行Southern杂交，经放射自显影得到DNA的限制性片段多态性。大多数RFLP标记表现为二态或三态，多态信息含量在0.2左右。
（二）RAPD标记 • RAPD技术是以随机引物（一般为8~10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分离扩增片段，经染色来显示扩增DNA片段的多态性。扩增片段多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物量各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。
与RFLP相比，RAPD具有以下优点①技术简单，检测速度快；②只需少量DNA样品；③不依赖于种属特异性和基因组结构，一套引物可用于不同生物基因组分析；④成本较低。但RAPD也存在一些缺点： ①RAPD标记是一个显性标记，不能鉴别杂合子和纯合子； ②存在共迁移问题，凝胶电泳只能分开不同长度DNA片段，而不能分开那些长度相同但碱基序列组成不同的DNA片段。 ③RAPD技术中影响因素很多，所以实验的稳定性和重复性差。
（三）SSR标记 • 微卫星DNA，又称简单序列重复（simple sequence repeat,SSR）,主要以1~6个核苷酸为基本单位，串联重复次数一般为10~50。同一类微卫星DNA可分布在基因组的不同位置上。每个SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列，根据这一特点可设计一对特异引物来扩增不同重复次数的SSR序列。经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，比较扩增带的迁移距离，就可知在不同个体间某个SSR座位上的长度多态性。
（四）AFLP标记 • 扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism,AFLP),设计对某种限制性内切酶的通用接头及可与接头序列的限制性酶切位点的序列配对的专用引物，通过PCR进行的限制性片段扩增，分析其长度多态性。可提供较多的基因组多态信息。 • AFLP实际上是RFLP与PCR相结合的产物，其基本原理是将基因组DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增，使用双链人工接头与基因组DNA的酶切片段相连接作为扩增反应的模板，接头与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列作为引物的结合位点。引物有三部分组成： ①与人工接头互补的核心碱基序列；
②限制性内切酶识别序列； ③引物3’端的选择碱基序列（1~10bp）。这样就只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制性酶切片段被扩增，再在高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物。该技术的独特之处在于人工设计合成了限制性内切酶的通用接头以及可与接头序列配对的专门引物，因此在不需事先知道DNA信息的前提下就可对酶切片段进行PCR扩增。具体实验过程中，为了使酶切浓度大小分布均匀，一般采用两个限制性内切酶，一个酶的切点数较多，另一个酶的切点数较少，因而AFLP分析中产生的主要是由两个酶共同酶切的片段。 • AFLP兼具RFLP和RAPD两种技术的优点，既有RFLP的可靠性，也有RAPD的灵敏性。设计的专用引物3’端还延伸出1~10个数量不等的随机核苷酸碱基，通过选用不同数量这种碱基可以调节AFLP产物的条带特异性和数量，从而提供较多基因组多态性信息。尽管AFLP技术诞生时间较短，但它的出现却是分子标记技术的一次重大突破，被认为是目前一种十分理想的、有效的分子标记。
