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二、基因工程的基本程序. b. 剪切. a. b. 载体质粒. 选出含有重组 DNA 的细胞扩增 表达. A. 引入宿主细胞. b. A. 外源 DNA 片段. 外源 DNA 插入. 第二章 基因工程中常用的工具酶. 第一节 限制性核酸内切酶与 DNA 分子的体外切割 第二节 DNA 连接酶和 DNA 分子的体外连接 第三节 其他工具酶. 第一节 限制性核酸内切酶与 DNA 分子的体切割. 限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链 DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割 DNA 双链结构的核酸内切酶。
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二、基因工程的基本程序 b 剪切 a b 载体质粒 选出含有重组DNA的细胞扩增表达 A 引入宿主细胞 b A 外源DNA片段 外源DNA插入
第二章 基因工程中常用的工具酶 第一节 限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割 第二节 DNA连接酶和DNA分子的体外连接 第三节 其他工具酶
第一节 限制性核酸内切酶与DNA分子的体切割 限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 • 一、寄主控制的限制与修饰作用如图2-1，图2-2 • 二、限制性核酸内切酶的制备方法 • 三、限制性核酸内切酶分类和命名 • 四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性 • 五、影响限制性内切酶活性的因素
分类： Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅰ ：识别和切割位点不固定，随机性。 Ⅲ ：核酸内切酶活性和甲基化活性是不分开的。 Ⅱ：能在识别位点处切割DNA，切割位点固定。核酸内切酶活性和甲基化活性是分开的。常用。
四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性 识别序列 ：1.4~7个核苷酸组成的特定核苷酸序列 2.回文结构：两个顺序相同的拷贝在DNA链上呈反向排列。 EcoRⅠ 5 ’-G AATTC-3 ’ 3 ’-CTTAA G-5 ’
经限制酶切割后的位点,DNA断裂类型 1.粘性末端 (1)3’-OH单链延伸的粘性末端.如：Pst Ⅰ 5’-CTGCA G-3’ 5’-CTGCA G-3’ 3’-G ACGTC-5’ 3’-G ACGTC-5’ (2)5’-P单链延伸的粘性末端.如：EcoRⅠ 5’-G AATTC-3’ 5’-G AATTC-3’ 3’-CTTAA G-5’3’-CTTAA G-5’
2.平末端 如:SmaⅠ 5’-CCC GGG-3’ 3’-GGG CCC-5’ 两种特殊的限制酶 (1)同尾酶识别位点不同，酶切后产生同样的粘性末段的两种酶。如：BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ (2)同裂酶 识别序列相同，对甲基化切点敏感性不同的两种酶 。如:Mbo Ⅰ和Sau3AⅠ共同识别序列GATC ，但对GmeATC切点,前者不能切，后者能切。
五、影响限制性内切酶活性的因素 • 1.DNA的纯度 • 2. DNA的甲基化 • （1）基因工程使用失去甲基化酶的大肠杆菌 • （2）研究基因工程DNA的甲基化程度 • （3）改变限制酶的识别特性 • 3.温度 • 4.分子结构 • 5.限制酶的缓冲液 • 星号活性 • EcoRⅠ切 GAATTC EcoRⅠ*切 pupuATpypy 或AATT
第二节DNA连接酶和DNA分子的体外连接 • 一、DNA连接酶 DNA连接酶（Ligase）是一种能够催化在双股DNA链的3′-OH和5′-P之间形成磷酸二酯键的酶，可连接互补粘性末端或平端以及缺口修复，不能连接单链DNA或裂口. 温度 • 二、DNA分子的体外连接
二、DNA分子的体外连接 • 1．粘性末端DNA片段的连接和单切点的磷酸化 • 2．平末端DNA片段的连接 • （1）T4DNA连接酶法 • （2）同聚物加尾法 • （3）用化学合成的衔接物连接DNA分子
第三节 其他工具酶 • 一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ • 二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶） • 三、T4DNA聚合酶 • 四、逆转录酶 • 五、末端脱氧核苷酰转移酶 • 六、核酸酶S1 • 七、核酸酶BAL31 • 八、外切核酸酶Ⅲ • 九、T4多聚核苷酸激酶 • 十、碱性磷酸酶 • 十一、 甲基化酶
命名 HindⅢ H: Haemophilus 嗜血杆菌属 in: influenzae 流感 d: Rd株 Ⅲ：该菌株中第三个被分离到的限制酶
同尾酶BamHI和BglII AGATCTGGATCC TCTAGACCTAGG BglⅡ BamHI A GATCC TCTAG G T4连接酶 AGATCC（连接后的切点均不能被上述两种酶切） TCTAGG
一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ • 1.三种活性 • （1）5’-3’聚合酶活性（在有dNTP时） • （2）3’外切酶活性 （无dNTP时大亚基活性） • （3）5’外切核酸酶活性（无dNTP时小亚基活性） • 2.在基因工程中的应用 ：缺口平移标记技术。
二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶） • 1.DNA聚合酶活性 （切除小亚基，保留大亚基） • 2. 3’外切酶活性（无dNTP时） • 3. 在基因工程中的应用 • （1）标记粘性末端. -32P—dNTP • 标记平末端 -32P—dNTP • （2）将5’端伸出的末端填平 • （3）可用来反转录合成双链cDNA。 • （4）补平粘性末端。
三、T4DNA聚合酶 • 具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性。其外切酶活性比E.coli DNA聚合酶I的活性高200倍。 取代反应
四、逆转录酶 逆转录酶可以RNA为模板，逆转录成cDNA第一链，又称依赖RNA的DNA聚合酶。 1.聚合酶活性RNA或DNA为模板 2. 3’外切酶活性 能使DNA-RNA杂合链中的RNA降解。 应用： • 1.RT-PCR 使mRNA逆转录成cDNA • 2.制备探针。
五、末端脱氧核苷酰转移酶 • 可催化DNA片段上的3’-OH端加接脱氧核糖核苷酸。 • 常用于同种碱基多聚体接尾反应 • 核素标记DNA片段的3’端
六、核酸酶S1 可以降解单链DNA和RNA • (1)将DNA切成平末端。有些限制性内切核酸酶可以将DNA切成粘性末端，经过核酸酶S1降解可切除DNA末端的单链。生成平末端DNA。 • (2)切除cDNA中单链发夹状结构。反转录反应合成的cDNA，可能形成单链发夹状结构，为了得到平末端cDNA可用核酸酶S1分解，生成无发夹结构的cDNA。 • (3)可用核酸酶S1分析DNA·RNA杂交分子的结构。
十、碱性磷酸酶 • 该酶的功能是以单链或双链的DNA、RNA为基质，将DNA或RNA片段5’端的磷酸切除，产生5’-OH。 • 应用： • (1)用该酶催化切除DNA或RNA5’端的磷酸,然后加上γ-32P-NTP在DNA多聚核苷酸激酶的作用下标记5’端。 • (2)用于避免单酶切后质粒自我环化。
十一、甲基化酶 • 常见的有dam甲基化酶和dcm甲基化酶，可使相应碱基甲基化。dam可在限制酶识别的5′GATC3 ′或5′GAAT3 ′序列的5′腺嘌呤N6位上引入甲基。dcm可在限制识别的5′CCAGG3 ′或5′CCTGG3 ′序列的5′胞嘧啶引入甲基。常用于使酶切位点中的碱基甲基化而避免降解，保护酶切位点。
核酸酶BAL31 从线形DNA分子两端（粘端/平端）以渐进方式切去单核苷酸，以形成寡聚核苷酸或制造末端缺失。此外也有类似于SI酶单链特异降解活性，可除去粘性末端或单链发夹结构。 外切核酸酶Ⅲ 能从线性DNA的3′-OH末端沿3 ′→ 5′方向切去单核苷酸，制造3 ′端缺失，制备DNA模板或特异DNA探针。 T4多聚核苷酸激酶 能将ATP上的γ位磷酸转移到单链或双链DNA或RNA的5′-OH上，可将γ-32P-ATP中的32P连接到5′端的5′-OH上，以完成寡聚核苷酸的核素标记。
八、外切核酸酶Ⅲ 它的功能是将带有3 ’-OH末端的双链DNA从3 ’到5 ’端方向切除，产生5 ’单核苷酸
