第一节：重 组

1. 第一节：重 组 DNA分子的断裂和重新连接导致遗传信息的重新组合，称为重组（recombination）。重组的产物称为重组DNA（recombinant DNA），所有的DNA都是重组DNA。由于重组，一个DNA分子的遗传信息可以和另一个DNA分子的遗传信息结合在一起，也可以改变一条DNA分子上遗传信息的排列方式。DNA重组广泛存在于各类生物中，说明重组对物种生存具有重要意义。通过重组实现基因的重新组合使物种能够更快地适应环境，加快进化的过程。此外，DNA重组还参与许多重要的生物学过程，比如重组在DNA损伤修复和突变中发挥重要作用。

2. DNA重组包括同源重组（homologous recombination）和位点特异性重组（site-specific recombination）。同源重组是更为普遍的一种重组机制，它可以发生在任何两种具有相同或相似序列之间，涉及到两个DNA分子在相同区域的断裂和重新连接。位点特异性重组发生在DNA分子特定的序列之间，需要特异性的蛋白质识别并催化特异序列之间的重组。位点特异性重组发生的几率相对较小。

3. Two paired DNA molecules Breakages occur in each paired DNA molecules Crossing over

4. rejoining Tow recombinants

5. 一、同源重组（homologous recombination） 同源重组（homologous recombination）发生在两个同源DNA分子之间。真核细胞减数分裂过程中，同源染色体彼此配对，同源染色体DNA片段发生交叉与互换。这是发生在真核生物中的同源重组。同源重组在接合、转导或转化后外源DNA整合到细菌基因组中。Robin Holliday提出的遗传重组模型是人们从分子水平上认识重组的基础。

6. First Meiotic Interphase (cells contain 4N DNA content) Figure 5-55, page 185 Bivalent sister chromatids align with each other, this act is termed synapsis. Synapsed sister chromatids are termed a synaptonemal complex)

7. 1. Holliday model 两条同源DNA分子彼此并排对齐，相互配对DNA中两个方向相同的单链在DNA内切酶的作用下,在相同位置上同时切开。在切口处发生链的交换，一个切口的3’端与另一切口的5’连接在一起，于是两条DNA分子通过单链交叉连接在一起，形成所谓的连接分子（joint molecule），也称Holliday结构（Holliday structure）。两条同源DNA分子之间的单链交叉位点被称作分支点。

8. 分支点可以发生移动，称为分支迁移（branch migration），分支迁移的结果是在两个DNA分子中形成异源双链区（heteroduplex）。异源双链区的两条单链分别来自两个不同的DNA分子。因为参与重组的两条同源DNA分子的碱基序列不一定完全一致，异源双链区往往含有错配碱基。

9. 链交换所形成的连接分子必须进行拆分，才能形成两个独立的双链分子。这需要再产生两个切口。反应结果要看切开的是哪一对链，如果切口发生在当初未切的两条链上，那么原来的4个链就全被切开，就会释放出剪接重组DNA(splice recombinant DNA)分子。一个亲本双链DNA 通过一段异源双链DNA 与另一个亲本双链DNA 共价连接起来。在异源双链区域的两侧进行着常规的重组过程。

10. 如果切口发生在当初被切的两条链上，连接分子拆分后将形成补丁重组体（patch recombinant）。分开的两个DNA分子除保留了一段异源双链DNA 外，均完整无缺。因此，连接DNA分子无论如何拆分，所形成的两个独立的DNA分子总有一段异源双链区，但是异源双链区两侧的重组未必同时发生。

11. Synapsed chromatids

12. Recombination joint Heteroduplex DNA

15. A A A A B B B B B’ B’ B’ B’ A’ A’ A’ A’ Holliday intermediates Holliday Intermediate (see Photo in Lehninger pg 962) Endonucleases aka. resolvases (e.g. RuvC) A B A B’ Products before DNA repair A’ B’ A’ B

17. Termed “patch recombinants”

20. 2. Meselson-Radding Matthew Meselson 和 Charles Radding对Holliday 模型进行了修改。Holliday模型要求在两个并排对齐的同源DNA分子的对应位点形成单链切口，从而产生游离的单链末端。然而，在Meselson-Radding遗传重组模型中，仅在一个双螺旋上产生单链切口。利用切口处3’-OH合成的新链把原有的链逐步置换出来，使之成为以5’－P为末端的单链区。随后游离的DNA单链侵入另一条DNA双螺旋中，取代它的同源单链并与其互补链配对形成异源双链区，被置换的单链形成D－环（D-loop）。

21. D－环单链区随后被切除,两个DNA分子在DNA连接酶的作用下形成Holliday交叉。与Holliday不同，此时只在一条DNA分子上出现异源双链区。如果发生分支迁移，在两条双螺旋上均出现异源双链区。随后发生的连接分子的拆解与Holliday模型一样。D－环单链区随后被切除,两个DNA分子在DNA连接酶的作用下形成Holliday交叉。与Holliday不同，此时只在一条DNA分子上出现异源双链区。如果发生分支迁移，在两条双螺旋上均出现异源双链区。随后发生的连接分子的拆解与Holliday模型一样。

24. 3.重组的双链断裂模型 DNA双链断裂（double-stand break, DSB）也会引发同源重组。根据该模型，重组时两个彼此配对的DNA分子的中的一个发生双链断裂，而另一个保持完整。双链断裂后，在核酸外切酶的作用下，切口被扩大，并且形成2个3’单链末端。其中一个单链末端侵入未打开的双螺旋的同源区，并取代其中的一条链，形成D环。随着侵入链被DNA聚合酶延伸，D环不断扩大，当D环的长度超过断裂DNA分子上被降解的区域，

25. 断裂DNA分子的另一3’单链末端就与D环的单链区退火，并作为引物被DNA聚合酶延伸。结果，断裂受体DNA分子上被降解的区域就以另一DNA分子上的同源区为模板得到了修复，同时形成两个分支点，分支点会沿着DNA移动，发生分支迁移。最终Holliday结构被拆分，形成两个独立的DNA分子，从而结束重组事件。同样地，依据拆分Holliday结构时所剪切的DNA链，可以最终决定DNA分子重组位点两侧的基因是否发生交换。断裂DNA分子的另一3’单链末端就与D环的单链区退火，并作为引物被DNA聚合酶延伸。结果，断裂受体DNA分子上被降解的区域就以另一DNA分子上的同源区为模板得到了修复，同时形成两个分支点，分支点会沿着DNA移动，发生分支迁移。最终Holliday结构被拆分，形成两个独立的DNA分子，从而结束重组事件。同样地，依据拆分Holliday结构时所剪切的DNA链，可以最终决定DNA分子重组位点两侧的基因是否发生交换。

29. Holliday 中间体是否真的存在？从细菌和动物细胞中可以分离出正在发生重组的质粒和病毒DNA。从它们的电镜照片上，我们可以发现与Holliday中间体类似的交叉和围绕着交叉点旋转形成的Holliday异构体。因此，无论重组的起始机制是什么，两个相连的DNA分子之间的交叉点都要发生迁移，并且Holliday结构要围绕交叉点发生旋转形成异构体。

31. 4. 大肠杆菌的遗传重组 通过遗传分析，在大肠杆菌细胞中已经发现了3种重组途径，即RecBCD、 RecE、RecF途径。以下步骤为这3种途径所共有：（1）产生一个具有3’－OH末端的单链DNA片段；（2）单链DNA侵入其同源双链DNA分子；（3）形成Holliday中间体，并发生分支迁移；（4）内切核酸酶对中间体进行切割，连接后产生重组体；（5）三种重组途径均需要RecA蛋白。

32. 与Meselson-Radding模型一样，细菌中的重组也是由单链切口发动的。然而，在大肠杆菌中引发重组的单链末端是3’-OH末端，而不是5’-P末端。在这里我们主要介绍由RecBCD酶复合体发动的重组途径，这也是大肠杆菌中最重要的重组途径。与Meselson-Radding模型一样，细菌中的重组也是由单链切口发动的。然而，在大肠杆菌中引发重组的单链末端是3’-OH末端，而不是5’-P末端。在这里我们主要介绍由RecBCD酶复合体发动的重组途径，这也是大肠杆菌中最重要的重组途径。

33. RecBCD具有多种酶活性，其主要的酶活性包括：ssDNA外切酶活性、dsDNA外切酶活性和解旋酶活性。解旋酶能够在SSB存在情况下使双链DNA解螺旋。RecBCD与dsDNA的末端结合，然后以大约每秒1 000 bp 的速度解开DNA双链，同时降解解旋产生的ssDNA。RecBCD对两条单链的降解速度是不一致的，它优先降解3’末端链。一个正在被RecBCD加工的DNA的末端会形成一个单链环和一个5’端拖尾。

35. RecBCD的酶活性受重组热点Chi的调节。Chi位点大肠杆菌基因组中的一种不对称的8 bp核苷酸序列，5′-GCTGGTGG-3′，Chi位点能够改变RecBCD的酶活性，它是大肠杆菌重组过程的必需组分，是重组的热点。一旦RecBCD识别出Chi序列，RecBCD核酸酶活性便发生变化，其3’→5’外切酶活性受到抑制，5’→3’外切酶活性被激活，由原来优先降解3’末端链，改变为只降解5’末端链。但是它的解旋酶活性未受到影响。

36. RecBCD酶活性变化的结果是产生3’末端带有Chi位点的ssDNA。目前仍不清楚RecBCD遇到Chi序列后，活性发生变化的分子机制。但是来自遗传学和生物化学的证据都表明，RecBCD与Chi序列的相互作用，导致了RecD亚基与复合体分离。RecBCD酶活性变化的结果是产生3’末端带有Chi位点的ssDNA。目前仍不清楚RecBCD遇到Chi序列后，活性发生变化的分子机制。但是来自遗传学和生物化学的证据都表明，RecBCD与Chi序列的相互作用，导致了RecD亚基与复合体分离。

37. 不论实际机制如何，RecBCD造成了游离单链末端，这一游离末端将侵入另一双链DNA分子。单链的侵入（strand invasion）由RecA蛋白介导。RecA是一种单链DNA结合蛋白，参与大肠杆菌中所有的同源重组事件。它催化一个双链DNA分子的3－末端单链区侵入另一个双链DNA分子，形成异源双链区，同时置换出同源单链，形成Holliday结构。

38. RecA介导的链交换可以分为三个阶段：RecA聚集在ssDNA上形成丝状结构的联会前阶段；RecA－ssDNA丝装结构寻找同源双链DNA分子并与之配对的联会阶段，在这一阶段可能形成三股螺旋（triplex）结构，入侵的ssDNA位于完整螺旋的大沟之中；发生链的交换，形成连接分子的阶段，入侵的单链置换出双链中的同源单链，产生一个长的异源双链区。RecA介导的链交换可以分为三个阶段：RecA聚集在ssDNA上形成丝状结构的联会前阶段；RecA－ssDNA丝装结构寻找同源双链DNA分子并与之配对的联会阶段，在这一阶段可能形成三股螺旋（triplex）结构，入侵的ssDNA位于完整螺旋的大沟之中；发生链的交换，形成连接分子的阶段，入侵的单链置换出双链中的同源单链，产生一个长的异源双链区。

40. 分支迁移和Holliday中间体的拆分 分支迁移由结合在Holliday分支点上的RuvA和RuvB蛋白催化。RuvA以四聚体的形式识别并结合到Holliday分支点上。RuvB蛋白为催化分支迁移的解旋酶，但RuvB自身不能有效地与DNA结合，它需要与RuvA一起起作用。RuvC蛋白催化断裂反应，切开极性相同的两条单链，拆分Holliday 中间体。

46. 5. 真核细胞的同源重组 发生在减数分裂过程中的同源重组有两方面的重要作用。一是确保同源染色体能够正确配对，而同源染色体的联会是生殖细胞形成时染色体数目减半的基础。另外，减数分裂重组也常常引起非姊妹染色单体之间的交换，结果是亲本DNA分子上的等位基因在下一代发生了重新排列。

47. 减数分裂重组是由染色体DNA双链断裂启动的。在减数分裂的前期I同源染色体开始配对的时候，Spo11蛋白在染色体的多个位置上切断DNA。Spo11的切割位点在染色体上并非随机分布，而是多分布于染色体上核小体包装疏松的区域。Spo11蛋白由两个亚基组成，每个亚基上特异的酪氨酸分别进攻DNA分子两条单链上的磷酸二酯键，从而切断DNA，并且在断裂处形成磷酸－酪氨酸连接，所以Spo11与拓扑异构酶及位点特异性重组酶具有同样的性质。减数分裂重组是由染色体DNA双链断裂启动的。在减数分裂的前期I同源染色体开始配对的时候，Spo11蛋白在染色体的多个位置上切断DNA。Spo11的切割位点在染色体上并非随机分布，而是多分布于染色体上核小体包装疏松的区域。Spo11蛋白由两个亚基组成，每个亚基上特异的酪氨酸分别进攻DNA分子两条单链上的磷酸二酯键，从而切断DNA，并且在断裂处形成磷酸－酪氨酸连接，所以Spo11与拓扑异构酶及位点特异性重组酶具有同样的性质。

49. 在断裂处，MRX酶复合体利用其5’→3’的外切酶活性降解DNA，生成3’单链末端，其长度通常可达1 Kb或更长。MRX酶复合体由Mre11，Rad50和Xrs2三个亚基组成，并以三个亚基的首字母命名。MRX酶复合体还被认为能除去与DNA相连的Spo11。